Способ получения протеолитического фермента из sтrертомyсеs caligosus ds 14486 штамм nrrl 8195

Патент 1001862

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

О Il И С А Н И Е ((i 100I 862

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл. (22) Заявлено 24.08. 77 (21) 2519807/23-04 (23) Приоритет вЂ” (32) 24.08. 76

С 12 N 9/48

С 14 В 1/02

Государствеииык комитет

СССР (31) 76 25631 (33) Франция

Опубликовано 28. 02. 83. Бюллетень Эй 8

Дата опубликования описания 28.02,83 (53) УДК 577.15. .07(088.8) Ilo декам иэобретеиий и открытий

Иностранцы

Андре Беллок, Жан Флоран, Иан Люнель, Иан-Клод Палла и Дениз Манси (франция) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Рон-Пуленк Эндюстри" (Франция) (?!) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЦЕСКОГО

ФЕРМЕНТА ИЗ STREPTOt1YCES CALiGOSUS DS

14486 ШТАММ МНИ 8.195

Изобретение касается способа получения нового протеолитического фермента микробного происхождения, который предназначен для использования исключительно в дубильном производстве для эпиляции кож.

Этот фермент может быть получен в искусственной среде с использованием новой культуры микроорганизмов, принадлежащих роду Streptornyces и име-lp ющих наименование StreptoIIIyces ca11gosus DS 14486 штамм NRR 8195.

Известен способ эпиляции, который состоит в обработке шкур посредством ванны иги пасты из щелочного восстановителя, составленного из извести и сульфида натрия t 1).

Этот способ эпиляции вызывает отделение шерсти путем разрушения ее связи со шкурой, при этом происходит растворение шерсти в обрабатывающей ванне, которая должна быть обновлена после каждой операции. Приходится избавляться от воды, сильно загрязненной сульфидом и органическими веществами, сбрасывая ее в обычные стоки, что приводит к весьма значительным загрязнениям рек и т.д. Стоимость сооружения и эксплуатации очистных сооружений слишком велика.

Известен способ ферментативной эпиляции, которая обеспечивает возможность уменьшения загрязнений вдвое по сравнению с предыдущим способом.

Эпиляция шкур посредством ферментов, воздействующих на эпидерму, которая связывает шерсть с кожей, позволяет собрать эту шерсть простой фильтраци-r ей содержимого эпиляционной ванны без возникновения загрязнений $ 2$.

Однако ферментативная эпиляция в таком виде, как она обычно используется, вызывает значительные повреждения эпидермы и даже дермы обрабатывае мых шкур, что ухудшает качество кожи.

Это является, в основном, следствием

toro, что селективность применяемых для этой цели ферментов по отношению к связке шерсть вЂ” кожа относительно невелика. В этих условиях фермент оди

1001

3 наково взаимодействует и с белками глубоких слоев кожи так, что кожа, полученная после такой обработки, име" ет поверхность, испорченную бороздками и углублениями, S

Цель изобретения - получение фермента, обладающе го более селе ктивным действием, обеспечивающим более эффективную ферментативную эпиляцию, без порчи кожи. о

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения нового протеолитического фермента из Streptomyces caligosus И 14486 штамм NRRL

8195, культивируют указанный продуцент 5 в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и в случае необходимости фактор роста, при начальном рН 5,8-7,8 и температуре

23-33 С с последующим отделением культуральной жидкости и выделением фермента.

Причем культивирование проводят обычно при аэрировании среды со скоростью аэрации 0,3-3 л воздуха на 1 л питательной среды в 1 мин.

Наиболее близким к Streptomyces саligosus DS 14486 является Streptomyces nobor i toens is, так как последний производит мелаиновый пигмент на органических средах, развивает на больши н ст ве пи та тел ьных сред более или менее густую темно-коричневую грибницу, в частности на картофеле, где он

35 образует вегетативную грибницу весьма густого коричневого цвета и имеет споро вую воздушйую грибницу серого ц вета.

Однако описываемый штамм следует отличать от известного, так как Ьйгерtomyces noboritoensis не образует повторяющихся спиралей споровых цепочек, не ожижает желатину или делает это слабо, не дает растворимого пигмента или дает только слаборастворимый ко45 ричневатый пигмент только на аспарагин-глюкозовом агарь, производит растворимый густой красно-коричневый пи r" мент на питательном агаре, тогда как

Streptomyces caltgosus DS 14486 образует споровые цепочки, которые регу5О лярно закручиваются в сжатые спирали, сжижает желатину, дает черный растворимый пигмент на глюкоэо-аспарагиновом агаре и дает серовато-коричневый растворимый пигмент на пита тельном агаре; Streptomyces noboritoens s образует также на содержащем, нитраты синтетическом агаре, на саха862 4 розе неокрашенную вегетативную грибницу, тогда как Streptomyces cal igosus DS 14486 на этой среде образует с ровато-коричневую толстую вегетативную грибницу; к тому же Streptomyces nobori 1оепы s не усваивает ни рамнозы, ни сахарозы, а усваивает (и очень ограниченно) только арабинозу, инозит и ксилозу, тогда как Streptomyces caligosus DS 14486 усваивает очень хорошо все эти источники углерода, Стрептомициновый штамм, который является организмом-продуцентом нового протеолитического фермента, извлечен из образца земли, ему присвоен номер OS 14486. Образец этого штамма находится на хранени:п в музее Nor-, tern National Research laboratory US, (Сельскохозяйственный департамент в

PE0PlA, Ш, CIIIA), где он зарегистрирован под номером NRRL 8195.

Этот организм ввиду его новых качеств, которые не позволяют отождествить его с уже описанными видами, сле. дует рассматривать как новый вид с наименованием Streptomyces са!1gosus

os 14486.

Выделение осуществляется по общему методу, который состоит s суспендировании небол ьшого количества земли в дистиллированной стерильной воде, в разбавлении суспензии до различных концентраций, в растекании небольшого объема каждого р азба вл ения по лове рхности чашки Петри, содержащей питательный агар. После инкубации при 26 С в течение нескольких дней, что позволяет микроорганизмам развиться, колонии, которые можно изолировать для проведения исследования, отбирают и пересажи вают на питательный агар для того, чтобы получить более обильное разведение. Streptomyces cal igosus

DS 14486 образует цилиндрические споры размером 0,8- 1,0 мк/0,6-0,8 мк. Он образует спороподобные гроздья; цепи спор могут насчитывать до нескольких десятков спор, они закручиваются в сжатые более или менее длинные спирали, образуя, в основном, 2-3 кольца, но довольно часто и до 6-8 или доже до 12 колец. По виду своего спорообразования Streptomyces са1igosus

DS 14486 размещается a Section Spira по классификации Придама.

Streptomyces са1igosus DS 14486 хорошо развивается при 2б С, плохо

Р при 37 С и совсем не развивается

Образуется

Происходит

5 1001862 4 при 50©C. Он имеет споровую воздушную точники углерода или азота для обесгрибницу серого цвета. Окраска ее ве- печения своего развития и степень раз. гетативной грибницы в зависимости вития, наблюдаемая на основной среде от питательной среды меняется от бо- с замещением глюкозы различными, солее или менее густой коричневой до 5 ответственно испытанными источниками темно-коричневой. На органических углерода, либо различными, соответст" средах, особенно на специальном ти- венно испытанными источниками азота розиновом агаре - дрожжевом экстрак- {SDg{NH@)<) показан в табл. 2. те Ваксмана f меланинобразующей сре- Для получения нового протеолитиде ), он дает вещество в довольно боль- iр ческого фермента выращивание Strepto- шом количестве с меланиновой окрас- myces ca i igosus DS 14486 штамм NRRL кой, которая придает среде темный 8195 можно осуществлять методом аэроб" оттенок; на многих синтетических сре- ного выращивания на поверхности или дах он способен производить в более в глубине, последний способ особенили менее значительных количествах 15 но удобен.Сэтой целью используют техрастворимый черноватый пигмент. нику засевания и ферментации, а также

В питательных средах поддержи- различные типы аппаратов, которые ваемых при 26 С, фермент обладает обычно используются в ферментационследующими биологическими характе- ной промышленности. рр ферментационная среда в принципе

Образование мела- Происходит является известной (7) и содержит источники усваиваемых углерода и азоОб зование Н та, минеРальные элементы и в слУчае необходимости факторы роста, все эти

Тирозиназа

25 элементы могут быть внесены в виРазжижение желатины де отдельных веществ или в виде сложII

Усвоение ц еллю- ных смесей, которые находятся в >биолозы логических продуктах различного проОбразование нит- Отсутствует на хождения. ридов из ни рз н тра- питательном бу-5р В качестве источника усваиваемого тов льоне, содержа- углерода можно использовать углеводы, щем нитраты, такие как глюкоза, сахароза, мальтопроисходит на за, декстрины, амидон или другие угсинтетических леродсодержащие вещества, как глицерин или некоторые другие органичесГидролиз амидона Происходит кие кислоты (молочная и лимонная кисПитательная среда Диспергирование лоты). Некоторые животные или растина снятом молоке без коагуляции тельные масла (свиное сало и соевое

Результаты выращивания Streptomy- масло) могут выгодно заменять эти

ces caligosus DS 14486 на различных рр различные углеродсодержащие источники питательных средах приведены в табл. 1. или могут быть добавлены к ним.

Культивирование проводят около Подходящие источники усваиваемого

3 недель при 26 С, кроме указанных ис- азота черезвычайно разнообразны. Они ключений. Эти характеристики наблюда- могут быть очень простыми химическиются на питательных агарахи бульонах : 15 ми веществами, например неорганичесобычно используемых для определения кими или органическими солями аммо.морфологических характеристик штам- ния, мочевиной, некоторыми аминосомов Streptomyces, выращивание на ага- держащими кислотами. Они могут быть ровых овых средах осуществляется на на- также внесены сложными веществами, соклонных агарах. Ряд использованных держащими азот в белковой форме: касред для выращивания приготовлено зеином, лактальбумином, глютеном и их по известным формулам, указанным, на- гидролизатами, соевои, арахисовои, пример в (3) -(6 3 В случае (3) со- рыбной мукой, мясными экстрактами, став среды обозначен буквой Ф и номе- дрожжами, растворимыми дистиллятораром который приписан ему в t 3). Со- ми и замоченным зерном, 9

55 ото. ставляющие других питательных сред Среди добавляемых элементов неко также известны (4) -(6). рые могут иметь буферное или нейтраОсобенность Streptomyces cal igo- лизующее действие, как, например, sus DS 14486 усваивать различные ис- фосфаты щелочных или щелочно-земель7 1001 . н,lx элементов или карбонаты кальция и магния. Другие приносят ионное равновесие, необходимое для развития

Streptomyces са! igosus DS 14486 и для переработки фермента, как, например, хлориды и сульфаты щелочных и щелочно-земельных элементов. Наконец, некоторые действуют более специфически как активаторы метаболических реакций Streptomyces са1igosus 0S 14486 вЂ” 1o это соли цинка, кобальта, железа, меди и марганца. факторы роста вЂ” это вещества типа витаминов, такие как рибофлавин, фолиевая кислота, пантотеновая кисло- 15 та. рН ферментационной среды при нача. ле разведения должно находиться в пределах 5,8-7,8, предпочтительно

6,2-7,4. Оптимальная температура фер- зо ментации находится в пределах 25-30 С, но удовлетворительный рост получается при 23-33 С. Аэрация брожения может меняться в широких пределах. Однако найдено, что аэрация 0,3-3 л воздуха 5 на 1 л бульона в 1 мин наиболее оптимальна. Максимальный выход фермента 24 199 RP получают после 2-8 дней развития, это время существенно зависит от используемой питательной сре- 30 ды.

Фермент может быть выделен из сусла для брожения следующим образом.

Сусло для брожения можно фильтроО вать в случае необходимости в присут- 55 ствии фильтрующего агента при том рН,которое создается в среде в конце процесса получения. Полученный фильтрат концентрируют до 1/5 первоначального обьема, затем фермент осаждается добавлением4О р аст вор ит еля, например ацетона. Неочищенный продукт может быть очищен путем фракционного осаждения с помощью твердых неорганических солей или водных концентрированных растворов, например сульфата аммония и/или растворителя фермента, например ацетона.

Продукт может быть также очищен пу, тем диализа через мембрану, предпочтительно через мембрану из регенери56 рованной целлюлозы.

Разведение Streptomyces са!igosus

NRPL 8 195 в описанных условиях позволяет получить фермент 24 199 RP белковое вещество, имеющее вид порош-, ка темно-коричневого цвета, достаточно хорошо растворимое в воде, очень слабо растворимое в концентрированном водном растворе нейтральных солей

862 8 (например сульфата аммония ) и в водноспи ртовых или водно-ацетоновых смесях, практически нерастворимо в спиртах и в безводных кетонах; масса его молекулы равна 27000 и его изоэлектрическая точка лежит при 3,7, Протеолитическая активность нового протеолитического фермента проявляется на большом числе белковых субстратов таких, как казеин, гемоглобин, фибрин (лизис сгустков крови) .или молоко (коагуляция) .

Активность на казеине определяется способом, аналогичным способу Кунитца. Пептиды, растворимые в трихлор уксусной кислоте, которые высвобождаются во время гидролиза, определяют" ся либо спектрометрически при 280 нм (тогда выражаются в единицах Кунитца), либо колориметрически. Активность выражается в мг тирозина, образующегося за минуту в условиях проведения определения.

Коагулирующая активность на молоке определяется согласно способу, предложенному Берриджем, и может быть выражена в единицах закваски (UP), оп-, ределение которых таково: одна единица закваски - это количество фермента, которое способно вызвать свертывание 10 см молока за 100 с.

Фибринолитическая активность определяется на сгустках стандартного фибрина, полученного действием тромбина на фибриноген, и может быть йыражена в литических единицах, определение которых следующее: раствор в 100 литических единиц на см (100 UL/cM ) это раствор, который лизирует станГ дартный сгусток фибрина за 30 мин.

Следующие примеры показывают как изобретение может быть использовано на практике, Активность продукта выражается в единицах KUNIIZ (UK), определенных выше. Эта активность выражается в U К/см, когда речь идет о растворе, и ОК/г, когда речь идет о твердом веществе.

Пример 1. В ферментатор на

170 л помещают:

Пептон, r 1200

Дрожжевой экстракт, r 600

Агар-агар, г 240

Вода q S p, л 105 рН среды 6 >55, Cтерилизуют, барботируя в течение 40 мин при 120 С.

После охлаждения из-за конденсации паров во время стерилизации объем

2 10

Получают 800 см водного экстракта, рН которого 7 и 7,5.

Этот экстракт поддерживают при +4 С и добавляют при перемешивании 344 г кристаллического сульфата аммония, перемешивание продолжают еще 15 мин, после окончания добавления оставляют в покое на 1 ч, потом отделяют нерастворимую часть центрифугированием при

10000 в течение 10 мин и при +4 С

Нерастворившуюся часть растворяют помешиванием в течение 1 ч в 500 см воды, подгоняя рН до 6-7,5,, и полученный раствор подвергают- диализу при

+4 С в течение 17 ч в дистиллирован" ной воде.

Получают 920 см диализированного экстракта, в который быстро заливают и перемешивают 1,1 л ацетона, охлажденного до - 10 С. Нерастворимый фермент отделяют центрифугированием при о

5000@ в течение 10 мин при +4 С, по" том высушивают при низком давлении при +4 C в присутствии обезвоживающего агента СР О ) ..

Окончательно получают 9,5 r фермента, ферментати вная активность которого следующая:

Протеазная активность, UK/г 1470

Коагулирующая активность, 0 P/ã 14500, Фибриноли тическая активность, UL/г 4920

Пример 2. 360 л сусла, полученного по примеру 1, Фильтруют на прессованном фильтре в присутствии 25 кг вещества, помогающег1э фильт" рации. К 200 л полученного фильтрата добавляют 400 л метанола, охлаждено ного до -10 С. После охлаждения смеси до -10 С полученный осадок отделяют путем холодного центрифугирования и высушивают при низком давлении при

35 С.

Отделяют 229 г фермента с активностью 290 U K/г.

В табл. 3 собраны результаты, полученные на различных субстратах с предлагаемым ферментом, 9 100 186 бульона становится равным 115 л, его дополняют до 120 л путем доливания

5 л стерильного водного раствора, содержащего 1200 г моногидратной глю. козы. 5 рН среды 6,80. Засевают 200 см перемешиваемой культуры Streptomyces са11цозиз DS 14486 штамм NRRL

8195. Культура развивается при 27 С в течение 23 ч с перемешиванием и 10 аэрацией стерильным воздухом; тогда она становится пригодной для засевания для продуктивной разводки.

Продуктивную разводку осуществляют в бродильном чане на 800 л, за- 5 груженном следующими веществами:

Перегнанный растворитель, кг 16

Сахароза, кг 6

Соевое масло, л 4

Сульфат марганца, кг 0,08

Вода, л 370 рН среды подгоняют до 7,3 путем добавления 850 см соды, потом она стерилизуется барботированием пара г5 с температурой 122 С в течение 40 мин

После охлаждения из-за конденсации паров во время стерилизации объем бульона становится равным 400 л, рН 6,60.

Засевают 40 л прививаемой культуры в бродильный чан на 170 л. Культура развивается при 27 С в течение

94 ч при перемешивании с помощью вра щающейся мешалки (205 o6/èèí) и при аэрации стерильного воздуха (20 м /ч), тогда получается рН культуры 7,30 и обьем сусла 400 л. Протеолитическая активность сусла при рН 7 и 37 C равна 3,6 U К/см .

Фильтруют 11 л сусла, полученного, как описано выше, потом промывают оса. док 4 л дистиллированной воды. Фильтрат и промывку соединяют, затем концентрируют до 2 л при пониженном дав- пении (5 мм рт.ст.), температура не ниже 30 С. К охлажденному до +4 С о концентоату быстро добавляют при перемешивании 2,4 л ацетона, предварительно охлажденного до -10 С, Продолжают перемешивать в течение 2 мин, затем нерастворимую часть отделяют центриФугированием при +4ОС и 5000с, в течение 10 мин. Полученную нерастворимую часть последовательно экстрагируют о

450 си, потом 150 см воды при +4 С в течение 2 ч, отделяя каждый раз нерастворенную часть центрифугированием при +4 C при 5000 в течение 10 мин.

Активность фермента проявляется в широкой области рН: оптимальная величина рК для гидролиза казеина около 7,5, и фермент сохраняет по крайней мере 604 своей максимальной активности при рН 5-8,5.

Максимальная активность фермента проявляется при температуре около

62 12 мешивания. Это может также осуществляться пропусканием обрабатываемых кож через машину для сгона шерсти, ко-. торая позволяет получать неповрежденную и несваленную шерсть.

Предлагаемый способ может произ-! водиться и/или следовать за большим числом дополнительных операций. Очистку шкур желательно производить до эпиляции. Она может состоять из мытья в воде в барабане или баркасе, предназначенном, в основном, для отмывки шкуры от солей, которыми она пропиты" вается при консервации . Промывка может следовать за обезжириванием с помощью обычных ароматических или хлорированных растворителей иги моющих водных растворов. Эта операция позволяет убрать большое число органических загрязнений, таких как жиры и неорганические вещества, которые пачкают шкуру и закупоривают волосяные мешочки. Обезжиривание было бы выгодно сопровождать новой промывкой водой таким образом, чтобы получить чистую шкуру (насколько это возможно), лишенную загрязнений и очищающих веществ.

После эпиляции шкуры промывают и воде позволяют стечь. Промывная вода содержит неповрежденную шерсть и фермент, которые могут быть разделены известными способами - декантацией, Фильтрованием.

Затем шкуры вводят в чистый известковый зольник, который гидролизует их. Этот зольник используется иного раз, так как шкуры, которые туда помещаются, практически чисты и только слабо загрязняют его.

Отмечено, что после обработки в зольнике лицевой слой кони не портится и прочно скреплен с дермой, тогда как шкура, эпилированная посредством ферментов типа алкалазы, имеет испорченный лицевой слой, студенистый при прикосновении, с оторванной, местами дериой.

Во время операции эпилирования сброс загрязняющих продуктов значительно уменьшается. Особенно заметно это по отношению к сульфидам и к раст воренной шерсти, которых теперь совершенно нет в сточных водах, тогда как они в изобилии имеются в отбросах, получаемых при эпиляции путем растворения шерсти.

После обработки шкур можно осуществить все обычные операции дубильного

11 1С018 >5 С, и активность очень быстро падает, когда температура превышает 50 С.

Специфичность фермента по отношению к кератину волос и кожи и к гликопротеинам волосяной луковицы и

lj волос животных не может быть выведена из активности, полученной на обычных субстратах, представленных в приведенных примерах, она может быть обнаружена только путем натурных испытаний t6 удаления волос так, как они описаны ниже. Ферментативная эпиляция с использованием полученного фермента заключается в том, что обрабатываемую шкуру приводят в соприкосновение с 15 ферментом в эпиляционном баке, в котором процент воды по отношению к шку. рам составляет 10-45 об. ., предпочтительно 20-253 Операция продолжается

3-24 ч, температура ванны находится 20 в пределах 24-30О С и рН соответствует максимальной протеолитической активности фермента, т.е. находится между

7 и 8,5; рН удерживается постоянным во время операции путем использова- 2s ния буферных растворов, создаваемых обычно добавлением тринатрийфосфата или буры. Кроме того, можно считать, что 0,3-1 вес.ч. шкур является той областью соотношений, в которой эф- зо фективность и себестоимость обработки оказываются наилучшими.

Практически способ обработки шкур состоит либо в погружении их в раствор, содержащий 10-30 г7л фермента, показатель активности которого около

290 UKgr, либо в применении опрыскивания из пистолета раствором, содержащим 1-10 г/л фермента, показатель которого около 290 0 К/г- (в случае овчины).

И в случае овчины, и в случае шкур крупного рогатого скота используемая активность фермента оптимальна, когда его концентрация и его показатель находятся в указанных выше соотношениях.

Емкостью для эпиляции служит любой бак или барабан, которые используются при известных способах.

Для того, чтобы удаление волоса с кожи было полным, действие фермента должно сопровождаться или предшествовать механическому вытаскиванию шер< ти. Это может быть просто трение одной шкуры о другую во время переме-, 55 шивания, дополняемое в случае необхо. димости сгонкой волос во время короткого периода более интенсивного пере13 1001862 14 производства: обеээоливание, пикеле- ности даже на вытянутых частях боков вание, хромовое дубление, спилка и животных подстрижка, повторное дубление, змуль- В табл. 4 приведены сравнительные сионная жировка, сушка, тяжка и чис- данные, полученные при зпиляции шкур товая обработка кожи. крупного рогатого скота тремя следующими способами: эпиляция с использоваПолученные таким образом кожи име- нием предлагаемого фермента (А); эпиют очень тонкое зерно, высокое качест ляция с использованием протеолитичесво по сравнению с теми, которые полу- кого фермента из Вас. subttlts (В) чены известково-сульфидным способом, lO и эпиляция известным путем с раствов них отсутствуют прожилки и они имеют рением волоса в ванне, содержащей иэочень хорошую адгезию .лицевой поверх весть и сульфид натрия (С).

1001862

r о

Х о

X !

С3

fz о и

S о а е

E !

С0

>Х о

S а о

С0

Iо

0 о и о

1Х

X с

1 о

1 о >s

1- 2 е ш

Ш Э о z

О. 3

Э о а

1 >S

О л

I- m

tg (D !

О Х о

Х а а е о

=г

Q. о

1 о

Э о

Y о

I о

Э вЂ” о

1 о

I>S

=г

О.

=г

z л

z е

>Х йл

z л

tD >Х

3 2

O 1S а Ш

>S Ш л е

1- Q.

Ш О о !о

О. tg е с о о

Н о а о

g >S

О О, а е

>Х

2 с

1 о

1е

Ш о о.

СЭ

>Я

2 О а З е о о а о

Х о

X с о о о

>Д

Ш е

1 о

Iо

О> о

L о а о

C о

m o о

С Э

С0 О

° >Х

С1

Э о о

Л !

О а

1О !ФХ

%Х с у о

С1

Ф о

L> о

1 о

S е

1е

Т fg

S Х х о

О3 а

s o а 1L V

К %

tU 1

S Х

Х У

Ю S S О.

О. О

1!3

Сl

Э о. о

1 е о

Х Y о а о о х

i- S о э

1СС е о

z У

1-, о е IIO а О>

OI ю с е

r о

О. о

1о

z о

CL о

1v tc

К и

tU Э . Z Х

I- 3 е s

CL CL ! о о

О Y

IXl

CL о

1 о

Х е

Iâ€”

I о е

X о

CL о

Iо.

К е

itQ

СС е

z ш е

S 1I» Е е и

1- о

Э Z

О.

Э fD

С0 J

tg а х е

L е

С0 о

ifg

lD ь

IC !

О и

S о. о

1- О

tD lD

1Э

C0 L

m а л

С3 о

С1

» о

Х ф

О 0

m а о о

3 о о х

z е

CL о х

IL Е с с

tX e

>Х

% S

% о fg

О. и со

ttI

Л fg

S Q.

l !

I !

I .1

С.С

Ф а о

К !

Х л с

1tg

1 >S а 2 е

Е tD

CL е

1с

Сl

fQ !

I»

CL е

IY а е

Е CL

>О

Ш о

Ф !

I 1

>.» tD

2 С

Ш Ш о я

Ш ° о а а fg

S ! вЂ” ф

2 t

Х LA

-л ! Я

1е а

l- tg

L е ам е r4 ! +

fg . )

CL 4

1 о. е

L 0 е о

Q. Ш

L Е

r!!

1 l

Хl

1-1

1! о 1! е!

1» 1

r еоо, б- а:т а 0! о m

lD f0 .!

«S >Е X CD I

2Sa

z )

Х Е

o у д х а:, =ге х

0cXz а;о о

mdiv s

2 а-=г

О о

1 ° о1

Э СО

Y C> о

Ф у о к а а е

СС S

Х Ш х е

С О. у

C:2

2 !Х 1а

ovr

Е а

OsfD

О.с m о э и с (> е

fQ а л

co cc c

° !>! о о О

a s

>,О X

° 2

c3 v r

1 о lO

:» с

L е

S с

Э с о

I е

М о !

X с е о.

X с

1fg и о

Г о

СЙ о о. с

=Г 1

S 3

Х S

lo а

s o

О. У

L о

z е S х е

Ш IS

1- о

m y

1- О !Х

Э Ц3 fg

1;>> m

Ф С Э

С0 .чо >s

0 X 2

o s

К I

О 1!

О fg о s о

fQ i»

O. tD е е 1l- Y О е + tg

1 S L

CL е >я >я

1- о о

4 X Z

>Я

2 I

5 Э»

=т

r !

С3

S а е ! Ш

Ic r

tg 3

z и Q.

x o

У е

1- О

Э 1-!

Э tD

Ю %

% о

l о

CL о ф

<и

0 х.e

V 1S Ф о с

Q. e

С E

% о с о

I- Е

tO 1»

m o

6 х

2 >S

S 2 а a>s

ОЕЗ

hC И 30 о

h*s

3- 2 я и )х

Е 23 а Я е x C

o Q.u

I о

Iе

Ol о )x

Х 2 а и.

Ol Е

z o ( о

I» е и о >s

* 2 а а е е

=г и

1 6 1, S I

1 Y и I

6 1

Ф! !

),(z

I х 1 S

I х

6< О !

1 1

%< 10 о !

CC1 X

I I о., I

1 Х tg ) ! Z и I

e l- 1

I У U 1

6 >S 1

X О

l Е и 1 с0 и 1

I (! ! l

1 1 ! I ! I

1 I

1 1 (I

I I

1 1

1001862

6 °

Y I

tO Х

fO S и. 3)c)

З о а х

ОО а с ио а с)3

e Y o хна х ио и

6 е

j ° 2 а асо о

a» e хо О х а

1-.* о

Ь ас<

1 I

2 >

X а 1о х

1 >S >Х

O2S

Q. dl М еео и z30

tQ ф l Х

z o

6 s а

Х,< Ф

6 6.3О

ХZX аббес анхо

e x

Ф с а

S (а е оех

c c; с

voe

SI0 а с х

6 6 с

52 v

3 е Ф е

З % 2 хvz

fO х о а у

t>3

X с а Э ас

I)х

Е 30 и е е

z o

a>s о з

Iх е о (- a а а о е

S X

З З .е х .и m

o e

>Х з о х е х и е о а е

<,С< .*", X

6 >Х и з

>S и л Ф (- а

fO Е

m x о а

6 а из и. >X

Iх х

6 и

У (>3 о е а.

tO ф

m. o о а

>Х О о 30 ае е

u o

Х о

1 !

1 Ф 1

1 "Г е 1 х 1 х О

30 аЗ

sîа а<-е и а

I и

1 IC IC 1

I Е Е>Е I

I 3

I I

1 1

1 I г вЂ” вЂ” - е

5 1 х е х .z

X X а а (о х

tQ U

Z и IL

x e

I- ItQ

OI е о

L CL

6 Е

m v

I о х

1 Ф о m (- е

v z

3- 3С

Ф 1 ао 8

«М

S з eL1-Z е о;

m a, tQ

X К о е и. а о е (- и

О1 о К 1tg Ф

Z и

I- Е

to z

30 S о и е о а о

I» и

tO е

X у

IC е х е е х а а

30 е о

Я о

CL х о

<х

t)3

1 о

I 6 с

1 6

1 I1 с>

) о х

3С

Х а е

CL е

8 о

О. о х л о

CL о х

% о

Iо

<а

I о !

Ос("Ь

О.

1 ео

I Х

CL S

<. 10

I х

Е I

a. o

Y е а х е х аух с ехо

1 U а е есх

Ф 2 х

z о а х )

E О

tQ т

Е IФ а и.

Е IL с(Х

fQ х ! е

ItQ

1 fg о

e c

I Ф а ы

1 Ф

I CC (I

I »

1 1

I X

1 X

1 30 t)3

>s >x s e

З ! Х 9 6

1 X Е L о м о

sa. a

I 5 6 О

< о а с аo и

O3 O

1 с X

I ххо и I- Х е о

6 Е

L X ie с s

СО X C

I, Ii

I !

I ! !

I, I

I !

3С О е У х ,й о

s c

}- 1tO 6

I- m

e o

I е to ф

К Z е 30 а s

6 О.

u <1 O е

I Х (х

6 а

1 6

< . >

1 о х

1 3 о

3 е ! с

3 S

1 X

3 К

CL S о

>Х а

2 О

-с- а

30 Х

0 s)X

I- E 2l

Е З Iй CL

oem

a.U и е tg ииа

L о е а

e cL с е

O 3

tQ Ф

I. о х

tO З о и

Зс 0 с<

Я Х 1

1С +.

)х

2 О

< B

6 о о

30 а а.

О о -x)s

E 2i

e20(й CLZ S

oeom аиcfo

tL3 О е с ийа

tQ с и

Ф Q.

)Х L

2i е

m г».

0 >S М

Х 2i 1 ао х х-

5 s а

X 1 tO ! Ф б

3 а е

>4 с

l и е х IC о е а и Я оео (- х (И 2 И

x o

)Х О- 3еое

zrm о е ох

Q.Yа

3006

О<0

1 Iо е С и и е

° . о к аe

О 3И 6

3Е

L (e o

z m е

e z а <х

30 х е о ас

I а < е % (и е

>Х х х е их<

6 6 )If

x c е

<- ге е и

<- ао

zea

s L e ие3с

1 ! ,1

С)

Щ!

I- (1

Э)

С)

О) о!

Ct.

I (М о ( о с о

Ф т л (»

% о

1:, о

2i о с

Я с (Э ( о

-с о

Ш о

r (О о

IS а

z о

Э т л (» о

j л с ,о С= с

X о с о

Ф о

U л о

m с

% а о х о с

1о

z с (D

I>х

1Щ (D

1 !

Б ш

S а о

1 о

)Щ

Б ш

Э х т

S а о

5С

1 л с

L о >Х

Э Х т о

O lO

CL о ш т о s а о

Э (>

Х 1

fg O а а в о щ л

)х

Б с

)О

I о о

Cl.

Э (2

lg о С

Ф с о

Ф (х

S (t)

tQ а

Б с (D

)О

1 о

1fQ ш о а

Э (.Э

Я л х ( о с

L о а о

>х

z о

Itg ш о а

Э (.Э (9

fg а о

Ф а

Б х

Х Z

Ф о

5, со а л

1 (O о

z х

:>»

)о

Ш о сГ

Э с о

Э т!

m о

Э о и (C

z о

I о

3 ю

I ! !

1 (g

Х о а о

S а о х

tg х о а о

Iи

Ck (g

I(g

S х

)О

L (Z (g

ltQ

lЭ

Э о х

1 о

)о с о

Y о

)Х о

tg Ш

О! Э

Ф Х

Z 5

X-CL ао о

1 о о

m а л

lК (О

Ш о а (C (g

I» (g (О

z л с

tg л ш

Щ х

)Щ

Ф о

z т

CL о

Ы (с л э

Х )О

1 (о

z о

lЩ

Ш о а

m а 8 о х

I X

О о

CL 1)U с о

О Э х (ц 5

Щ X

3 о

CL о х.К

О)

CL о х

Э с

4Э

Я о о

CL о х

Щ х

° »

X л о с о о (:5 о

Х о с

О о

Ст о

Z о с о (=

Э х о

X х о

X (О

S (О

Z .Ш

Щ lт о

Э >s

X O

tQ Ш

m o х

«Яв й

X Z х о

lO Cl

SOЧ:

Cl 1- Э

1-о а)

К К ххо

Э Щ

L S lЭ С S

t (!

I о

1О а fg

Э х s

m а

s О

)- х

Щ t

)- о

Э lL а %

CL (Cо щ

1- m

100 1862

1 л ш

CL (С

:>» (О

l- lo tg с m ло а

Э к о

Щ 1

1- о о с

X Э

З 10 л ( (: X (О л х о о ( л (O

)х

1tg а

С;

)tg

ы (Q

X а

Э (? о о

Э о х

S а

=т

I» (D

l?.

S (>.за

tQ (Е

CL о

К (О

Z с

)Щ

I а (Q

L (О

Э т х

Y о

Э т

S (Э

X (> с

Щ х

tg х

Ф с

:г а

1 х о С

X (5»

fg о (lл щ из а

Щ х

1 Э

:Г

Z Я о с о L (Л (О

0) tQ

Э с

fg з х о с л

100)862

X O

X I ! < 1 е с а л

LZ: е а о

У V

1 Ф х 5

Л с

g®

m às

Z Е X у У =Г

lg и <ф л

° 1- Z..

>Х е X

Я и

zoх а а.

Э Х 3 .

% о о с

9 о с з

X х о

Э Z .<)

36 5 о <<>3 K

Э X цр Z

m x

X Э

=т X

Е <>3

cc< S

S х Э о з

I- lO с m е с с v

:>> о о с х

-о л%

m C

9 х у м х аэ>х о т s

У О У

I о

>х о з

У m о е

Ig x

С X а

Ф .У

)S з х а

=г

1 о

S х

<о

«l.

L е

S х <С

<а lg

S и а э

< Z ю

z o и У

<- о.

Е Y

<- о

Ф <а о л э с и е а

=Т (К

s e х ttD e

У а ct

1 Е

Ф е о

Z и Я

I- К е е

I- I9 О ! < е о сп tФ и S

lg Iа о о о х з х о а а э о m х о с е а е л х

I.«е с <л х С й

I. о

Э х

S а о

У с

Т о сС е

Z и

Ilg

IЭ

I е

>Я з и

S а>s о х

Y о

Э л о с а о Ф

ы и е

Э а.

Z л

Л о.

О, о х! ° Ю, v. m

0 и =3

<>< О

s а о о

УЭС о о с*о

OZL хео

C x

Э и 3Е оое

Z с( кео х<-а

ovc

1 °

Е 1

Z ci

Ф 3

<х э

9 а 1е х

<<-.

Г 1<

1 < а

I С сс е

Iо дР

S <3

) 1

1 Э 1

< S 1

У < о 1 ае 9

1 е х I

9Х 1 х . 1

1 S

I с о и

<х < X з

О х и е v

У 1

1 Э I

1 1 е

m !

>Х 1

1 З 1

< Z 1

1 S I

1 а 1

О Iй Z

I- X <

О 3

1 Е Е

C 1

1 Х l 1 е о ! CL < а. и ое-

l C>t 1

< >X >X Э 1

S х a Э

1 Z Е 1

О 36 О

aa<

1:1 Э О

< ! 1

1 Е

=т е

z o

<а а-л

so« а<- е

< оat

I о а <С е е>к

О и I- Z 1

s9o а с

lg lO Э

1- О 1э е 1 (S I- I

ЭСх <

cnsC ! вЂ” вЂ” -т

К 1

s I

I- <

X 1

m 1

<>3 1

lg а. 1

Il 1

Z .I

Э. 3 с <

Э I

<- 1 () 1

lg 1

Э 1 а 1 о 1

К 1

lg 1 х 1 о 1 с <

Ф <

1- 1 е <

<- 1

> X 1

l <: 1

I о и

V O lg аа

>Я з -о с И эзо

CL CL э о

ovx

I- 1 еоо йS о<- «л а е t; t9mo s

ovmm

1 !

I !

1 !

I ! !

I !

К t

Е I и 1

9 1

Х 1 г

1 а 1

О 1

Y 1

1 1 о

Z а

Э г

1 !

I !

1 !

1001862

Испытанный источник

Усвоение

Усвоение углерода азота

Положи тел ьно

N0< !la

so (ин ) и

Положительно

0-Манноза

Мочевина

L-Сорбоза

Лактоза

Глюкозамин

Гликокол

Мальтоза

II o

Саркоэин

DL-Ала ни н

Сахароза

Трегалоза

Целлобиоза

Dh-8алин

Раффиноза

Кислота-5h аспартиновая

Положи тел ьно

Декстрин

L-Аргинин

Инулин

Амидон

Гликоген

L-Лизин

DL-Серии

DL-Треонин

DL-Метионин

Отрицательно

Таурин

Положительно

0-Манитолл

D-Рибоэа

0-Ксилоза

L-Арабиноза т"Рамноза

0-Глюкоза

D-Галактоза

0-фруктоэа

Глицерол

Эритритол

Адонитол

Дулситол

Положительно NO Na

РО Н(ИН4)

Аденин

Аденозин

Урацил

Отрицательно L-Аспарагин

Отрицательно Кислотаглютаминовая

DL-Фениллаланил

Положительно !..-Тироэин

Таблица 2

Положительно, но медленно

1001а62

Продолжение табл. 2

01-Пролин

Хис тиди н.

Ограниченно L-Триптофан

Бетаин

Т а б л и ц а 3

1 ) Субстрат Реакция Активность

Казеин Протеолиз 1470 ОК/г

Молоко Свертывание 14500 0Р/г фибриоген Лизис сгуст- 4920 QL,/мг ков фибрина н

% о

Реакция при рН 7,5 и при 37 С, концентрация субстрата 5 г/л.

1 Реакция при рН 6,35 и при 32 С на