Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы

Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик («> 1 004472

° (63) Дополнительное к авт. сеид-ву

Р11М. Кл.э (22) Заявлено 13. 05.81 (21) 3289227/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) ПриоритетC 12 N 9/34

С 12 и 1/20

Государствеииый комитет

ССС P ио делам изобретеиий и открытий

Опубликовано 1 0383. Бюллетень ¹ 10

{53)УДК 557.15 (088.8) Дата опубликования описания 15.03.83 (72) Авторы изобретения

Г.В. Черкасова, Т.В. Полянская, Н.А. Беляев

И.М. Фроловский и Б.A. Величко 1 .б

Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический.институт (7t) Заявитель (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОИ СРЕДЫ

ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ГЛИКОАМИЛАЗЫ

Изобретение относится к микро)биологической отрасли промышленности, в частности к ферментной, а именно к приготовлению питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы.

Известен способ приготовления питательной среды для культивирования цродуцентов глюкоамилаэы, предусматривающий приготовление 16-20Ъ-ной суспензия кукурузной муки, разввривание суспензии муки при 149-176оС (давление 5-12 атм) в течение 3045 мии, охлаждение разваренной массы, внесение амилолитическнх ферментов в виде солода в количестве 1-ЗЪ к весу муки, гидролиз муки при 63 С, охлаждение гидролизата до 33-37 С, добавление глутаминовой кислоты, стерилизацию среды и охлаждение ее.

Приготовленную таким образом среду засевают продуцентом глюкоамилаэы, в качестве которого используют Aspergillus awamori и культивируют продуцент до максимальной активности глюкоамилаэы в среде (160+290 ч) f1).

° Недостатками описанного способа являютсь . раэваривание муки при вы-. соких,температурах, что требует наличия специальной аппаратуры и расходования значительного количества электроэнергии; применение солода, для приготовления которого используется высококондиционное зерно, получаемая среда вязкая, что затрудняет процесс аэрации среды, в связи с чем увеличивается продолжительность процесса культивирования.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности .и достигаемому положительному эффекту является способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилаэы, предусматривающий приготовление суспензии муки, введение, в суспензию амилотических и целлюлолитических ферментов, гидролиэ суспензии, добавление в гидролиэат источников азота и минеральных солей с последукщей сте« рилизацией среды. При этом суспенэию муки разваривают при 127-138 С (1,5-2,5 атм) в течение 1,5-2. ч, амилолитические ферменты вводят постадийно, сначала в количестве 0,20,5 ед/г муки в суспензию муки, охлажденной до 95-90" и затем после I

О снижения температуры до 85-.80 С в количестве 0,8-0,5 ед/г одновременно с крахмало м, а ферментные препараты

1004472

Г пектиназы нли целлюлозы вводят после

10-минутного гидролиэа амилазами, внесения остальных компонентов среды и доведения. рН до 4,5, в количестве 0,5 ед Пкй или 1 ед С íà r cyxux взвешенных веществ среды. Гидролиэ осуществляют в течение 1 ч, доводят рН до 6,0 и стерилиэуют среду (2).

Недостатком известного способа является разваривание сусченэии муки, что требует множительных энергозат- ®0 . рат и многократный гидролиэ крахмалосодержащего сырья, что значительно усложняет процесс приготовления с реды °

Цель изобретения — ускорение и

15 упрощение процесса приготовления питательной .среды.

Поставленная цель достигается тем, что в способе приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы, предусматривающем приготовление суспенэии муки, введение в суспензию амилолитических и целлюлолитических ферментов, гидролиз суспензии, добавление в гидролиэат источников азота и минеральных солей с последующей стерилизацией среды, в суспензию муки до-полнительно вводят пшеничные отруби, а также пектолитические и протеолитические ферменты, причем соотношение муки и отрубей в суспензии соот» ветственно, вес.%,10-14 и 4-8-, а ферменты вносят в суспензию в следующих количествах,ед/г смеси муки и 35 отрубейг ймилолитические 1;5-10

Целлюлолитические 0,1-1

Пектолитические 0,1-1

Протволитические 0,1-1 46

С целью использования среды для непрерывных процессов культивирования продуцентов глюкоамилазы иэ полученного гидролиэата суспензии муки и отрубей выделяют жидкую фракцию, в 45 которую допол.нительно вводят гидро,лиэат крахмала, а источники азота и минеральные соли вводят в смесь гид" ролиэатов крахмала и суспенэии муки и отрубей.

Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилаэы заключается в следунж ем.

Готовят суспвнзию, содержащую 10». 55

14% муки и 4-8% пшеничных отрубей, рН . суспенэии устанавливают 4,5-6,3, полученную суспеизию нагревают до 4060 С и вносят амилолитические, пектолитические и. целлюлолитические фер- 0 менты в количествах, соответственно равных 1,5-10 и по 0,1-1 ед на 1 г смеси муки и отрубей, суспенэию выдерживают при 45-90OC s течение 0,52,0 ч.

При использовании среды для .периодического процесса культивирования продуцентов глюкоамилаэы в полученный гидролизат вносят иточники азота, в качестве которого могут быть использованы дрожжи, автолиэат.дрожжей, солодовые ростки, вытяжка солодовых ростков, кукурузный экстракт, соли аммония, азотнокислые соли и источники фосфора — фосфорнокислые соли.

Приготовленную таким образом среду стерилизуют 40-60 мин при 121О С.

При использовании среды для непрерывных процессов культивирования продуцентов глюкоамилазы из полученного гидролизата муки и отрубей выделяют жидкуюфракцию фильтрованием или центрифугированием.

В жидкую фракцию гидролизата вносят гидролизат крахмала, источники азота и фосфорнокислые соли.

Полученную среду стерилизуют и охлаждают. указанные ферменты можно вносить одновременно, при этом гидролиз проводят в две стадии, первую из которых при рН 5,5-6,3; температуре 4555О С, в течение 10-60 мин, а вторуюири 70-90 С в течение 20-60 мин или.первую стадию при рН 4,5-5,0, температуре 45-55 С в течение 2060 мин, а вторую при рН 5,8-6,3, .температуре 70-90 С в течение 1040 мин. указанные ферменты можно вносить и последовательно.

В приготовленную суспензив муки и отрубей с рН 4,5-5,0 можно вначале внести пектолитические и целлюлолитические ферменты в количестве

0,1-1,5 ед на 1 г смеси муки и отрубей, гидролиз осуществить нри 4555 С в течение 30-60 мин, затем рН изменить до 5,8-6,3 добавлением аммиака, внести амилолитические и протеолитические ферменты в количествах,соответственно равных 1,510 ед и 0,1-1 ед на г смеси муки,и отрубей, и суспензию прогидролизовать при 70-90 С в течение 10-60 мин.

Пример 1. В ферментер Биолафит Б-50 наливают 5 л воды, включают мешалку и, подогрев до 40 С, вносят

1,8 кг муки, затем наливают еще 5 л воды и вносят 0,6 кг пшеничных отрубей, объем суспензии доводят до

14,4 л, рН суспензии устанавливают

5,0 и вносят 0,8 г Амилосубтилина

Г10х, 0,48 r Целловиридина ГЗх и

8,9 г Пектофоетидина ГЗх, растворенные в воде (0,6 л), температуру суспенэии поднимают до 50 С и выдерживают 30 мин, затем температуру поднимают до 85 С, выдерживают 10 мин.

Полученный гидролиэат .при окрашива.нии иодом не изменяет окраски.

1004472

Затем в гидролизат вносят вытяжку солодовых ростков 0,75 л, (NH4) 50

90 r, NH4H

33ОС в течение 120 ч при аэрации и перемешивании. В процессе культивирования отбирают пробы. Активность глюкоамилазы в глубинной культуре через 96 и 120 ч культивирования соответственно равна 108 и 118 ед/мл (по глюкозооксидазному методу).

В контрольном опыте при культиви- 35 совании этого же штамма на среде, приготовленной по прототипу, актив- ность глюкоамилазы в глубинной культуре на 120 часу роста равна 121 ед/мл.

Пример 2. В ферментер (Био- 7п лафит Б-50) наливают 5 л воды, вклю чают мешалку и подогрев до 40 С, вносят 1,5 кг муки, затем наливают еще 5 л воды, вносят 1,2 кг пшеничных отрубей, объем суспензии дово-дят до 15,0 л рН суспензии устанавливаЮт 4,5, вносят 54 г Целловиридина ГЗх и 100 r Пектофоетидина ГЗх, температуру суспензии поднимают до

50ОС, выдерживают при этой темпера- З0 туре 60 мин, затем рН суспензии устанавливают 6,0 и вносят 0,9 r Амилосубтилина Г16х, растворенного в во де, поднимают температуру до 855 С, зыдерживают при этой температуре

20 мин, затеи в полученный гидролизат вносят вытяжку .солодовых ростков и соли, как описано в примере 1.

Приготовленную среду стерилизуют при этом же режиме, охлаждают до ,40 С и вносят посевной материал Asperg i I 1us awamor i 1(ультивируют при

33 С, перемешивании и аэрации в течение 120 ч. Активность глюкоамилаэы в глубинной культуре составляет

128 ед/мл. 45

Пример З..Приготовление среды осуществляют так же как в примере 1, но наряду с амилолитическим нектолитическим и целлюлолитическим препаратом в суспенэию муки и отрубей вносят протеолитические ферменты в количестве 34,3 г.

При культивировании Аsреrgi!1us

awamor i на данной среде активность глю ° комилаэы на 120 часу равна 137 ед/мп, Пример 4. Приготовление гидролизата суспензии муки и пшеничных

50 отрубей осуществляют так же, как опи сано в примере 1. Полученный гидролиэат фильтруют, твердую фазу используют для повторного гидролиза, а в жидкую фазу гидролизата муки и

ВНИИПИ Заказ 1801/35

r.Óærîðîä,óë.Íðîåêòíàÿ,4

Филиал ППП ."Патент", отрубей вносят 0,45 л гидролизата

1011 суспензии крахмала., 0,15 л ку,курузного экстракта, 0,60 л.экстракта биомассы и соли, указанные в примере 1.

Полученную среду стерилизуют, ох лаждают, засевают Asperg ilius awamori, культивируют при 33ОС, аэрации и перемешивании в течение 96 ч.

Активность глюкоамилазы в глубинной культуре. составляет 112 ед/мл,,затем включают проток со скоростью 0,0208 ч и продолжают непрерывный процесс культивирования в течение 10 сут.

Средняя активность глюкоамилгзы в глубинной культуре составляет 65-75 ед/мл.

Таким образом, реализация изобретения позволяет ускорить и упростимь . процесс приготовления среды, а также снизить затраты электроэнергии и расход муки, сохранив высокую актив,ность глюкоамилазы.

Формула изобретения

Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы, предусматривающий приготовление суспензии муки, введение в суспензию амилолитических и целлюлолитических ферментов, гидролиз суспензии, добавление в гидролизат источников азота и минеральных солей с последующей стерилизацией среды, о т л и ч а ю щ и и с„я тем, что, с целью ускорения и упращения процесса приготовления среды, в суспензию муки дополнительно вносят тпаеничные отруби, а также пектолитические и протеолитические ферменты, причем соотношение муки и отрубей в суспензии соответственно, вес.%, 1014 и 4-8, а ферменты вносят в суспензию в следукщих количествах,ед/г смеси муки и отрубей:

Амилолитические 1,5-10

Целлюлолитические 0,1-1

Пектолитические 0,1-1

Протеолитические 0,1-1

2. Способ по п. 1, с т л и ч а юшийся тем, что, с целью использования среды для непрерывных процессов культивирования продуцентов глюкоамилазы, из полученного гидролизата суспензии муки и отрубей выделяют жидкую фракцию, в которую дополнительно вводят гндролизат крахмала, а источники азота и минеральные соли вводят в смесь гидролизатов крахмала и суапензии муки и отрубей.

Источники информации., принятые во внимание при экспертизе

1. Патент CtQA 9 3988204, кл.С 12 0 13/10, опублик. 1976.

2. Авторское свидетельство СССР по заявке 9 2821191/28-13, кл. С 12 и 9/34, 1979.

Тираж 521 Подписное