Способ получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы @ @ @

Способ получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы @ @ @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ШЕЛОЧНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ BdciKPus interrned-lns IP, включающий глубинное культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, биостимулятор, коагуляцию биомассы и кислых белков подкисяением до рН 2,6-3,0, осаждение белка сульфатом аммония и фракционирование фермента на фосфоцеллюлозе, отличающийся тем, что, с цепью повышения активности рибонуклеаа в культурапьной жидкости и ВЫХОДИ целевого продукта, в качестве биостимулятора используют дрожжевой экстракт или кислотный экс-г тракт продукта Витамин кормовой (Л в количествах,, соответственно равных 0,05 и 0,3 вес.% от среды.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„, Я0„„1010125

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ASTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (1 ) 322 1738/28-1 3 (22) 23.12.80 (46) 07.04.83. Бюл. № 13 (72) И. Б„Лещинская, Г. И, Клейнер,, Б. Я. Паэгле, Л. В. Знаменская и и Э. Д. Михлин (7 1 ) Казанский ордена Лени на и ордена

Трудового Красного Знамени государст. венный университет им. В. И. Ульянова-Ленина (53 ) 577.1 5(088 .8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

¹ 587156, кл. С 12 М 9/22, 1976, 2. Голубенко И. А. и др. Рибонуклеаза

SacilMus intermedins 7р. Очистка хроматографией на фосфоцеллюлозе и некоторые характеристики гомогенного продукта. -"Биохимия, т, 44, вып. 4, М., 1979, с. 640-647 (прототип). уапц С 12 И 9/22; С 12 М 1/20 (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ШЕЛОЧНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ Bali Plus intermedhns 1р, включакнций глубинное культивирование продуцента на питательной среде, сойержашей источники углерода, азота, минеральные соли, биостимулятор, коагуляцию биомассы и кислых белков подкислением до рН 2,6-3,0, осаждение белка сульфатом аммония и фракционирование фермента на фосфоцеллюлозе, о т л и ч а юш и и с я тем, что, с целью повышения активности рибонуклеазы в культуральной жидкости и выхода целевого продукта, в качестве биостимулятора используют дрожжевой экстракт или кислотный экс-. a тракт продукта "Витамин В. кормовой в количествах,. соответственно равных

0,05 и 0,3 вес.% от среды.

Среды масса, %

Контроль (среда с 2% семипалатинского пептона) 100+ 8

100+ 1

Кукурузный экстракт 1%

Кукурузный экстракт, 3%

92+ 12

31+3

230+ 1

Тунгопептон 2%

250+ 1

64 2

Исходная среда + дрожжевой экстракт 0,01%

133+ 2

0,05%

0,1%

133+ . 1 .922 2

120+ 3

245k 3

Исходная среда + кислотный экстракт "Витамин B кормовой 0,075%

102+4

100+ 1

133+ >

0,15%

130> 3 1 1010125

Изобретение относится к получению Цель изобретения — повышение активферментов, в частности внеклеточной ше ности рибонуклеаэь в культуральной жид лочной рибонуклеазы микробиологическим кости и выхода целевого продукта. путем, и может найти применение в меди- Поставленная цель достигается тем, пине, пишевой промышленности и проиэвод- что согласно способу получения внекле,стве реактивов для молекулярной биоло- точной шелочной рибонуклеазы Ьас ИоБ гии и биоорганической химии. ntermedins 1р включающий глубинное

Известен штамм 56ciPPUs intBrm8dh hs культвирование продуцента на питательпродуцент шелочной внеклеточной ри-, ной среде содержащей источники углерода, бонуклеазы, обладаюший активностью 16 азота, минеральные соли, биостимулятор, 2000-2500 ед. подученной культивиро- коагуляцию биомассы и кислых белков ванием продуцента на среде определенно- подкислением до рН 2,6-3,0,осаждение го состава. белка сульфатом аммония и фракционироРибонуклеаэная активность в эаводс- вание фермента.на фосфоцеллюлозе, в каких условиях после 20 ч культивирования честве биостимулятора используют дрож10 000 ед 1). жевой экстракт или кислотный экстракт

Известен способ получения гуло,"енной, продукта "Витамин В. кормовой" в колишелочной внеклеточной рибонуклеазы Во с%-,чествах, соответственно равных 0,05 и

3US itltBFtn8®п5 ?р включаюший глубин 0,3 вес.% от среды.

Ное культивирование продуцента на сре- 0 Сушность изобретения состоит в том, де содержашей источник углерода — глю- что из перечня известных биостимулятокоэу источник азота — пелтон и минераль ров биосинтеза ферментов установлено ные соли, коагуляцию биомассы и кислых, опытным путем, что единственными для белков подкислением до рН 2,5-3,0 осаж данного продуцента, повышаюшими, акт:. вдение белка сульфатом аммония при рН 2 ность щелочной внеклеточной рибонук8 5 Фракционирование фермента на катио- леазы„являются дрожжевой экстракт и ,ните, например, карбоксиметилцеллющо . кислотный экстракт витамина В 2 кормозе (2), вого в строго установленных количествах, Однако выход препарата фермента явля- В табл. 1 показана зависимость активется недостаточно высоким и составляет g ности РНКазы и выхода биомассы от раз6-7 мг на литр культуральной жидкости. личнгях биостимуляторов.

Таблица

1010125

Продолжение табл. 1

142+ 3

150+ 2

144+ 1

0,3%

0,3 5%

135+ 4

Как видно из табл. 1 использование кукурузного экстракта, который является комплексным источником органического азота, витаминов, минеральных элементов

35 тов и пр. и широко используется для интенсификации процессов в кимробиологической промышленности, а также тунгопеп тона — пеп тона растительного п роисхождения — приводит к увеличению урожая биомассы более чем в два раза q

24 но резко снижает количество РНКазы в культуральной жидкости. И тоьлко введение дрожжевого экстракта и кислотного экс тракта ви тами на В„ кормового (ГОСТ

18666-73 ) в указанных концентрациях

2S (0,05 и 0,3 вес.% соответственно) при водит к увеличению количества РНКазы в культуральной жидкости на 33-44%.

Пример 1. В 150-литровый ферментер загружают 100 л среды сле- 34 дующего состава, %: глюкоза 1,0; пептон 2,0; СаС g 0,01; M

0,03; ИаС0 0,3; Ìn304. 0,01, рН 8,3 (до стерилизации).

Среду засева ю т 2 4- часовым ин оку пятомм (1%) полученным при выращивании

Вам ИиЬ inter rnedins 7 р на среде того же сос тава. Процесс ферментации веде тся в течение 24 ч при 29оС. Выделение и очистку фермента ведут известным спо- 44 собом. Результаты представлены в табл.2.

Таблица

100,0 36 103 1 3. 10 3

100 3,6

Культурная жидкос ть

101,0 35- 10

1,3 10

99 3,5

13-1О" 1,Ç 1ОЗ

94 3,С

26,0

Фильтрат после подкисления и удаления осадка

Концентрат 1 (концентрирование на ротационном о испарителе при 37 С) Пример 2. Культивирование и очистку фермента ведут аналогично примеру 1 с добавлением в среду 0,05 вес.% дрожжевого экстракта. Результаты представлены в табл. 3.

Пример 3. Культивирование и очистку фермента ведут аналогично при— меру 1 с добавлением в среду 0,3 вес.% кислотного гидролизата витамина В кормового. Результаты представлены в табл.4, При культивировании Bacillus inter medins 1p на средах с добавлением биостимуляторов наблюдается увеличение урожая клеток на 90% при добавлении в сре;ду дрожжевого экстрата и на 50% при добавлении в среду кислотного экстракта витамина В„кормового, что приводит к повышению концентрации рибонуклеазы в среде на 30-40% или до 48-58 мг/л против 32-38 мг/л в контроле (пример 1).

При более высокой активности рибонуклеазы в культуральной жидкости процесс последующей очистки фермента происходит эффективнее, с меньшими потерями и выход готового продукта увеличивается в

2 раза.

В табл. 2 представлены результаты выделения и очистки .рибонуклеазы при культивировании Вас. inter medinS р на контрольной среле (пример 1 ).

1010125

Продолжение табл. 2

Сульфат-аммониййая фракция (САФ}

12 10б 4 0.10

2,0

4,5

4,9-1O

39 104

Диализат САФ

23 104 94 10

7,3

47 1,7

КонцентратЦ(см. концентрат ) 53 10 9,5 10

3,0

43 1,6

Лиофилизирова нный проду 1

130,0 12 10 9,5 ° 10

42 1,5

После хроматографии на фосфоцеллэжозе "Recoatè 4,0

27-104 2,6 10

30 1,1

0,3

Йиализат 6

0,6

Концентрата(см. концентрат g ) 75 10

7,2- 10

0,09

18 0,67

Диофилизированный продукт

0,65 1 .10 ед./мг

7,0- 10

17 0,65 о

В табл. 3 показано выделение и очист- п1ргтийп lp на среде, содержашей дрожK& рибонуклеазы при культивировании Вос. жевой экстракт (пример 2).

Таблица 3

1,8 10

Культурная жидкость 1 00,0

48. 10

100 4,8

Фильтрат после подкисления и удаления осадка 100,0

45 10 1,7 - 10

4,5

g5.1@4 1 8.103

28,0

После хроматографии на

ИЭА Э-целлкаозе

RoanaE, После рехроматографии на фосфоцеллюпозе

"4latmсхп.Концентрат 1 (концент:рирование на ротационном испарителе при

37 С) 32 10 7,1 10

12 ° 10 7,2 ° 1О

66 2,4

49 1,8

27 0,97

20 0,72

1010125

22 105 3,3 103

70 104 7 4 103 фракция (САФ)

Лиализат САФ

1,8

4,0

4;6

3,2

Йосле хроматографии на ЙЭАЭ-целлклозе

"geon Å"

42.104 1,8 10

7,5

3,2

13 10 1 9-104

2,3

3,1

29 103 1,9.104 ед/мг

2,9

25 104 4,9 105

2,3

65-10 7,0 ° 10

20 10 7,2 10

1,9

0,3

Диализат 1!

1,2

0,62

80 10 7,2 10

1,2

0,15 ь едlмг

7,2. 10

1,2

1,2

В табл. 4 показано выделение и очистка рибонуклеазы при культивировании /ac,. ЬФы.им-д.ила .+ р

50 10

1,8.- 10 97

1 00,0

5,0

16 10

1,8 10 95

30,0

4,8

Концентрат Й (см. кон. центрат I ) Лиофилизированнь и продукт 1 12,0

После хроматографии на фосфоцеллклозе" РесяпаК" 9,0 !

После рехроматографии на фосфоцеллклозе

"ФМглап"

Концентрат Й! (см. концентрат 1 ) i

Лиофилизированный продукт й

Культуральная жидкость 100,0

В

Фильтрат после подкисления и удаления осадка

Концентрат I (концентрирование на ротационном испарителе при 37оС) на среде, содержашей кислотный екстракт витамина В, кормового (пример 3).

52 10 1,8 10 100 5Q

10 продолжение табл. 4

; 1010125

Сульфа аммонийная фракция (САФ) 2,0

4,4

Йиализат САФ

3,7

5,0

42 104 1 4 10

3,4

8,0

16 105 1 4 104 62

3,2

2,0

Лиофилизированный продукт Х

3,1

1 20,0

55" 10+ 4 0.10 53

5,0

2,3

0,25

Диализат

1.,4

0,5

Концентрат Й1 (см, концентрат 1) 13. 10 7, 1- 10 26

1,3 52

0,1

Лиофилизированный продукт Й

7,1 ° 105 26

1,352

1,352

Составитель И, Привалова

Редактор М. Петрова Техред M. Коштура Корректор М. Шароши

Заказ 2408/3 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ ГосударствеHHoFo комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„д. 4/5

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

После хроматографии на

ЙЭАЭ-целлюлозе

"P« ac"

Концентрат Й (см. концентрат 1 ) После хроматографии на фосфоцеллюлоае

Rqana9"

После рехроматографии на фосфоцеллкиозе

«ФаФ.man"

22 10 3 6 10З, 84

72 10 7,5 10Э 70

26 103 1,5 ° 104 60 ед/мг

91 10 7, 1 10 44

28. 10 7,1 ° 10 27

1 ° 10 ед/мг