Способ количественного определения фактора @ в плазме крови

Способ количественного определения фактора @ в плазме крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПгаДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА X В ПЛАЗМЕ КРСЖИ, включающий получение субстратной плазмы, смешивание ее с нормальной разведенной плазмой, внесение е полученную смесь активатора сверьтывания и опреаелевие протромбинового времени смеси, отлвчаюши и с я тем, что, с целью повышения сохранности нативных свсЛств плазмы, а также удешевления способа, получение субстратной плазмы осуществляют путем внесения в питратную смешанную человечёскую плазму слабоосновного анионообменного декстранового геля, содержаще- 1Х диэГиламиноэтипьные функциональные группы с преимушестванным ионным обменом для белков с мол. мае. ЗОООО20ОООО дальтон при ионной силе О,25М осаждение геля осуществляют отстаива кием, далее отбирают надосадочную субстратную плазму, а в качестве актива (Л тора свертывания используют тромбопластинкалыхиевую смесь.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

6NtWml

РЕСПУБЛИК аЕ (11) ggy G 01 И 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPGKOIVlV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЬЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 ) 3331993/28-1 3 (22) 05.08.81 (46) 07.04.83. Бюл. № 13 (72) А. Ш. Бышевский, О. А. Терсенов . и С. Я. Стасенко (71) Тюменский государственный меципинский институт (53) 612.115 (088.8) .. (56) 1.0ил-еи р А.1.aprocwvekiwe.—.

"Rev,йета1о1, 1952, ¹ 7, р. 147.

2. Баркаган 3, С. Исследование системы гемостаза в клинике. Барнаул, 1975, с. 134- -135. (54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА Х В ПЛА

ЗМЕ КРОВИ, включающий получение субстратной плазмы, смешивание ее с нормальной разведенной плазмой, внесение в полученную смесь активатора свер тывания и опрецеление протромбинового времени смеси, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения сохранности нативных свойств плазмы, а также удешевления способа, получение субстратной плазмы осуществляют путем внесения в цитратную смешанную человеческую плазму слабоосновного анионообменного декстранового геля, соцержащего циэтиламиноэтильные функциональные группы с преимущественным ионным обменом для белков с мол. мас. 30000200000 дальтон при ионной силе 0,25М осажцение геля осуществляют отстаива: кием, далее отбирают надосацочную суб. стратную плазму, а в качестве активатора свертывания используют тромбопластинкальциевую смесь.

1010562

Изобретение относится к медицине, в частности к способам опрецеления факторов свертывания крови., Известен способ определения факторов Х и УП, прецусматриваюший получение субстратной плазмы, развецение нормальной плазмы, смешивание их, определение ротромбинового времени сме- си „1j ..

К нецостаткам способа относится нарушение нативных свойств плазмы.

Наиболее близким к прецлагаемому по технической сушности и достигаемому эффекту является способ количесгвен« ного определения фактора Х, прецусмат»риваюший получение субстратноЦ плазмы, смешивание ее с нормальной раэвеценной плазмой, внесение в полученную смесь активатора свертывания и опрецеление протромбинового времени смеси.

Согласно этому способу получают субстратную плазму (уцаление иэ нормальной человеческой плазмы факто ров Х и УП) путем фильтрования через асбестовый фильтр, раэвоцят нормальную смешанную (смесь равных объемов плазмы 5-10 зцоровых люцей) человеческую плазму буфером Михаэлиса (ряд разве,дений от 1:10 no 1:1000); смешивают равные объемы (по 0,1 мл) субстратной и нормальной разведенной плазмы с послецуюшим опрецелением протромбинового времени этой смеси; строят калибровочную кривую на основе данных, полученных при определении протромбинового времени всех приготовленных разведений нормальной плазмы, опрецеляют протромбиновое время при смешивании исслецуемой (развеценной 1:10),ïëàçìû с субстратной; содержание факторов УП и Х (%) в исследуемой плазме устанав ливают с помошью калибровочной кривой.

В качестве активатора свертывания используют змеиный яд $2) .

К нецостаткам известного способа относится то, .что фильтрование плазмы через асбест с целью удаления фактора Х попутно привоцит и к удалению фактора УП; условия фильтрования приводят к нарушению нативных свойств плазмы; использование в качестве активатора свертывания змеиного яда заметно ограничивает цоступность способа и обуславливает его дороговизну; отсутствие в субстратной плазме фактора УП и нарушение нативных свойств плазмы при фильтровании через асбест снижает качество, опрецелений.

10 ную смесь активатора свертывания и определение протромбинового времени смеси, получение субстратной плазмы осушествляют путем внесения в цитратную смешан15 ную человеческую плазму слабоосновного анионообменного цекстранового геля, соцержашего циэтиламиноэтильные функциональные группы с преимушественным ионным обменом цля белков с мол. мас. 30000-200000 цальтон

25

30.полученную смесь вносят 5,0 мл геля

ЪЭАЭ ефацекса А 50, предварительно набухшего в 0,25 М растворе хлорица натрия. После осторожного помешивания

З5 в течение 0,5 ч и осажцения гранул геля пипеткой отбирают плазму. Полученная плазма при рекальцифицировании не свертывалась в течение 1 ч. Эту плазму используют в качестве субстратной.

50

Бель изобретения - повышение сохранности нативных свойств плазмы, а также уцешевление способа.

Поставленная цель достигается тем, что, согласно способу количественного опрецеления фактора Х в плазме крови, включаюшему получение субстратной плазмы, смешивание ее с нормальной

° Ф разведенной плазмой, внесение в полученпри ионной силе 0,25М, осажцение геля осушествляют отстаиванием, цалее отбирают нацосацочную субстратную плазму, а в качестве активатора свертывания используют тромбопластин-кальциевую смесь.

Приме р 1.К50млнормала ной смешанной цитратной плазмы человека (по 1 мл от донора) цобавляют 5,0 мл

0,36 М раствора хлорица натрия. В

0,1 мл нормальной смешанной человеческой плазмы, а также разведенную плаз» му (1:1, 1:2, 1:4 и 1:8), смешивают с 0,1 мл субстратной плазмы. После инкубации на воцяной бане при 37 С

У (15 с) опрецеляют тромбопластиновое время смеси. Для разных раэвецений плазмы оно слецуюшее, с:

Бельная + 0,1 мл субстратной плазмы 127+4,7

Разведеннаяя 1:1+0,1 мл - » 166+5,4

1:2+0,1 мл -"- 213+7,6

1:4+0,1 мл -"- 285+10,6

1:8Ю,1 мл " 349+12,3

На основании цривеценных, данных строят калибровочную кривую (график зависимости соцержания фактора Х в смешанной нормальной плазме or времени свер3 1010

tbIBGHHQ субстрагной плазмы). 3а 100% принято время свертывания, установленное при смешивании цельной нормальной плазмы c ..равным количеством субсгратной. 5 .Пример 2 . К 25 мл нормал ной смешанной циграгной плазмы человека добавляют 25 мл 0,36 М раствора хлорида натрия (для достижения в плаз-ме итогового значения ионной силы ОЯ%ю), tO

В полученную смесь вносят 25 мл геля

ДЭАЭ - сефадекса А 50, предварительно набухшего в 0,25 М растворе хлорица натрия. Смесь осторожно помешиваюг . в течение 0,5 ч, после чего цают осесть И гранулам сефадекса. Надосацочную плазму отбирают пипеткой и используют в качестве субстратной (лишенной фактора Х). Полученная плазма при рекальцификации не свертывалась в течение 60 мин. 20

Внесение извне гомогенного препарата фактора Х сокращает время свергывания при рекальцификации цо 33-35 с, что свидетельствует об отсутствии в полученной плазме фактора Х. В качестве 2$ контроля цля построения калибровочной кривой используют смешанную человеческую плазму, развеценную 0,14 М раствором хлорида натрия (развецения: цельная, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16). щ

В пробирку, установленную на воцяной бане, при 37 С вносят 0,1 мл суб562 4 страгной плазмы и 0,1 мл нормальной смешанной плазмы. После инкубации (15 с) вносят в пробирку тромбопластин-кальциевую смесь и фиксируют время свертывания. В полулогарифмическом масштабе построят кривую разведения по зависимости тромбоплас типового времени or разведений нормальной стандартной плазмы. Время свертывания неразвеценной плазмы принимают эа 100%.

Пользуясь этой кривой, определяют со держание фактора Х в исследуемых об разпах плазмы.

При использовании предлагаемого

Ф способа для определения содержания фактора Х в плазме здоровых люцей (50 цоноров) обнаружены инцивидуаль ные колебания:от 87 цо 105%.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет уменьшить время свертывания плазмы с 168 цо 125 с, что свицегельсгвует о большей чувствительности пригогов ленной йо предлагаемому способу плазмы к действию фактора Х; при разморажи вании субсграгной плазмы уменьшить время свертывания ее в присутствии фактора Х и тромбопластин-,кальциевой смеси с 206-235 цо 134-143 с, что указывает на высокую сохранность нативных свойств плазмы, и снизить стоимость одного опрецеления в 3;5 раза.

Сосгавигель С. Каспаров

Рецакгор Л. Филь. Техрец Т.Маточка Корректор И. Шулла

Заказ 2482/35 Тираж 871 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по. целам изобрегений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., ц. 4/5

Филиал ППП "Пагенг", r. Ужгород, ул. Проектная, 4