Способ получения протеинового комплекса,стимулирующего секрецию инсулина

Способ получения протеинового комплекса,стимулирующего секрецию инсулина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВОГО КОМПЛЕКСА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО СЕКРЕЦИЮ ИНСУЛИНА, заключающийся в том, что патогенные штаммы микроорганизмов , относ вциеся к виду BordeteEKa pertussis, в 1-ой фазе культивируют в жидкой питательной среде при встряхивании , полученную культуральную жидкость прогревают, отделяют надосадочную жидкость, пропускают ее через колонку, элюируют целевой продукт фосфатным буфером с 0,5 М NaC8 рН 7,0, полученный элюат концентрируют , очищают и разделяют протеиновый комплекс методом ступенчатой хроматографии на компоненты КС-1 с мол.вес. 63000+5200, KC-1I с мол.вес. 31000±4500 и/или КС-111 с мол.вес. 12500+1500..

СОЮЗ GOBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕ(НИХ

РЕСПУБЛИК

1 1

1 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2628100/28-13 ! (22) 09.06.78 (31) 69154/77 (32) 10.06.77 (33) Япония (46) 15 .04 .83 . Бюл . 9 14 (72) Есинора Канбаяси, Конти Хосода, Акира Ито, Сигеки Курокава, Цутому Накамура, Кацуми Ногимори, Таира Окамото, Акио Терасимо, Шаму Такахаси, Мотоюки Ядума, Тиканори Томиака и Митио Уи (Япония) (71) Кокенсяку Како Кабусики Кайся (Япония) (53) 615,45!612.398 (088.8) (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВОГО КОМПЛЕКСА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО СЕКРЕ,.SU „„1012786 А

3(Р) A 61 К 35/74//С 12 Р 1/04

ЦИЮ ИНСУЛИНА, заключающийся в том, что патогенные штаммы микроорганизмов, относ ящиеся к виду Bordetet t a

pertussis, в I-ой фазе культивируют в жидкой питательной среде при встряхивании, полученную культуральную жидкость прогревают, отделяют надосадочную жидкость, пропускают ее через колонку, элюируют целевой продукт фосфатным буфером с 0,5 М НаСР рН 7,0, полученный элюат концентрируют, очищают и разделяют протеиновый комплекс методом ступенчатой хроматографии на компоненты КС-I c мол.вес . 63000+5200, КС-II с мол .вес . .31000 4500 и/или КС-III с мол.вес.

12500+1500. Я

1012786

Таблица 1

Относительный 45 выход

Штаммы

Патогенные

Маепо (контрольный) 50

100

126

Tohama

9 3379 В

18-323

М 7341

112

60

Непатогенные

Sakairi

Miyazaki

Изобретение относится к микробиологии и касается получения протеинового комплекса, который может быть использован в медицине, при лечении и предотвращении различных видов диабетов. 5

Цель изобретения — получение протеинового комплекса, стимулирующего . секрецию инсулина.

Цель достигается тем, что способ получения протеинового комплекса, стимулирующего секрецию инсулина, заключается в том, что патогенные штаммы микроорганизмов, относящиеся к виду Bordetett à pertussis, в 1-ой фазе культивируют вжидкой питатель- 5 ной среде при встряхивании, полученную культуральную жидкость прогревают, отделяют надосадочную жидкость, пропускают ее через колонку, элюируют целевой продукт фосфатным буфером с

0,5 M НаСР рН 7,0, полученный элюат концентрируют, очищают и разделяют протеиновый комплекс методом ступенчатой хроматографии на компоненты

КС-1 с мол. вес; 63000+5200, КС-Il с мол. вес. 31000+4500 и/или КС-XII с мол.вес. 12500+1500. Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, является белковым веществом, которое может быть получено при культивировании микроорганизмов, принадлежащих к микроорганизмам Вогс)е еИ à pertussis, которые являются патогенными бактериями например, бациллы коклюша, паракоклюша и бронхиальной септице- 35 мии), причем наиболее предпочтительными являются Bordetet Q à pertussis первой стадии.

Способность патогенных микроорганизмов вида Bordete9pa pertussis 40 по продукции протеинового комплекса приведена в табл. 1.

Выделение и Очистку протеинового . комплекса иэ культуры осуществляют с помощью известных способов, например осаждения, хроматографического метода, метода с использованием молекулярных,сит, электрофоретического и биологического методов, причем с иопользованием либо каждого в отдельности, либо в соответствующих сочетаниях. 5

Способ с использованием хроматог- рафической колонки является удобным для выделения и очистки комплекса, при этом надосадочную жидкость культуральной среды, пропускают через колонку, заполненную такими носителями, как гидроксиапатит, СМ-сефароза

С -бб, Coh A-сефароза 4 В или РАМАсефароза 6МВ. Протеиновый комплекс адсорбируется в колонке, а затем элюируется из нее подходящим элюирующим веществом, например буфером

0,1 М фосфата (рН 7,0), содержащим

0,5 М НаСР. Очищенный продукт подвергают диализу, чтобы избавиться от ненужных солей, после чего получают чистый протеиновый комплекс.

Комплекс присутствует также в культивируемых клетках бактерий, при необходимости его выделяют, добавляя НаСР к суспензии для выщелачивания комплекса в раствор.

Для получения протеинового комплекса можно испольэовать метод осаждения сульфатом аммония, в этом случае твердый сульфат аммония добавляют нюуосадочной жидкО ти куль уры до точки, приближающейся к растворимости насыщения, и устанавливают рН 6-7 разбавленной аммиачной водой.

Затем осадок промывают водой, а комплекс экстрагируют из 0,1 М трисбуФера (рН 8), содержащего 0,5 М НаСЦ .

Порошок протеинового комплекса, полученного сушкой при температуре ниже точки замерзания, после обессоливания не расплывается на влажном воздухе, белого или светло-коричневого цвета, растворяется в воде При комнатной температуре в концентрациях до 3-5 мг/мл. Если его поместить в б н.HCR, то он образует нерастворимый белый осадок. Растворяется в пиридине, додецилсульфате натрия, меркаптоэтаноле и растворе цистина. При добавлении смеси сухого льда с ацетоном или зтанолом, трихлоруксусной кислоты или раствора хлористого цинка или раствора, содержащего некоторые другие типы ионов металлов, к

Раствору очищенного активного материала в охлажденном состоянии (4"С) получают мутно-белый осадок. Если протеиновый комплекс помещают в смешанный раствор воды и хлороформа или .

H-бутанола, то он становится нерастворимым и собирается около поверхности раздела обеих жидкостей.

1012786

Если водный раствор протеинового комплекса нагревать до 80 С или выше, он становится мутно-белым. Таким же образом, если этот комплекс растворить в 0,1 М фосфатном буфере (РН 7, О), содержащем О, 5 М Naca, а затем подвергнуть диализу, используя в качестве внешней жидкости дистиллированную воду, комплекс постепенно становится мутно-белыМ, однако при продолжении диалиэа комплекс снова 10 растворяется и белая муть исчезает.

Если раствор с высокой концентрацией подвергнуть тщательному диализу с использованием 0,01 М ацетатного буфера (pH 4,5), то комплекс может при-15 нять светло-коричневую. окраску и раствориться.

Молекулярный вес протеинового комплекса 77000+6400. Содержание белка более 95 вес.Ъ, а содержание 2О глюцида приблизительно 1Ъ, концентрация липидов меньше нижнего предела определения.

Композиционное отношение мкМ/100 N, 16-или 24-часовой гндролиз при 110 С в 6 н .HCR . Аспаргиновая кислота

7,5-7,9, треонин 6,8-7,6, серии 5,97,6, глутаминовая кислота 9,7-10,8, пролин 5,5-6,4, глицин 8,7-9,6, аланин 9,1-10,8, цистин 1,5-2,6, валин 5,6-6,.6, метионнн 2,5-. 3,3, изолейцин 3,6-4,1, лейцин 7,5-8,0, тироэин 5,1-6,6, фенилаланин-3,33,9, лизни 3,1-4,4, гистидин 1,41,6, аргинин 6,1-6,6.

Протеиновый комплекс оказывает стимулирующее действие на секрецию инсулина, это действие длится от нескольких недель до нескольких месяцев после введения единичной дозы.

Острая токсичность ЬО псоставляет 40

200 мкг/кг живого веса для мышей штам!

4@ Ййу .

Протеиновый комплекс разделяют на три компонента с помощью хроматографии на колонке в присутствии из- 45 вестных средств для .денатурации белков, таких как 8 М мочевина и б М хлоргидрат гуанидина.

Гель-Фильтрация в пРисУтствии

8 М мочевины предусматривает раство- . рение протеинового комплекса в 0,1 М .Фосфатном буфере (pH 7,0), содержащем 8 М мочевины и 0,.5 М ИаСВ, затем полученную смесь подвергают гельфильтрации на колонке, заполненной

Сефакрил S-200, находящимся в равновесии с укаэанным буфером. В результате протеиновый комплекс разделяют на три компонента с различным молекулярным весом (КС-I с мол.вес.

63000+5200, KC-II с мол. вес. 31000+

4500 и КС-III с мол.вес. 12500+

1500), и дополнительная гель-фильтРация на той же колонке приводит к тому, что эти компоненты при диско- 65 вом электрофореэе выходят как отдельные вещества.

Другим способом выделения и очистки комплекса может быть хроматьграфирование на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой, при этом протеиновый комплекс растворяют в 0,01 M фосфатном буфере (pH 8,0), содержащем 8 М мочевины, затем пропускают через колонку с целлюлозой ДЕАЕ, уравновешенной тем же самым буфером. Соответственно, KC-1 и КС-II адсорбируются на этой колонке, KC-III не адсорбируется, а протекает вниз, КС-1 элюируют

0,02 М фосфатиым буфером (РН 7,0), содержащим 8 М мочевины, а КС-II элюируют 0,05 М фосфатным буфером (РН 6,0) . Эти компоненты при дисковом электрофорезе проявляются как отдельный вещества после гель-фильтрации через колонку с Сефакрилом 8-200, уравновешенную 0,1 М фосфатным буферным раствором, содержащим, 4 М мочевины и 0,5 М хлористого натрия.

Полученные таким образом компоненты

КС-I, KC-II и КС-111 обладают более низкой стимулирующей активностью секреции инсулина, чем исходный протеиновый комплекс °

При некоторых условиях Разделения протеинового комплекса на составляющие его компоненты каждый из компонентов можно разделить далее на более мелкие белковые фрагменты. Например, разделение протеинового комплекса с использованием 0,1 М фосфатного буферного раствора, содержащего

4 М мочевины, 1Ъ 2-меркаптоэтанола ,и 0,5 М NaCP с последующей гельфильтрацией через колонку с сефакрилом $-200, уравновешенным указанным буферным раствором, приводит к получению 5 белковых фрагментов, которые содержат два дополнительных компонента вдобавок к трем компонентам. В отдельности вещества КС-I КС-II

КС-III обладают недостаточной активностью стимулирующей секреции, но их соединение в определенные группы, например, KC-Г и KC-III, КС-.II u

KC-II1 н КС-Х и KC-III приводит к высокой активности, а сочетание KC-I и КС-11 является неактивным. Когда компоненты KG-I u KC-III, КС-11 и

KC-111, КС- I, KC-II и КС-III и КС-I и КС-II взаимодействуют в определенном буферном растворе, они образуют отдельные белковые ассоциированные соединения, которые названы ассоциированными веществами KCA-1, KCA-II, KCA-III u KCA-1У соответственно.

Белковые ассоциированные вещества получают следующим образом.

Смешивают соответствующие сочетания элементарных веществ, взятых в соотношениях КС-I-. КС-II=5:1 в случае KCA-I; КС-1I:ÊÑ-111=2:1 в случае

KCA-111 КС-1:KC-II:ÊÑ:111=5 :2г2 в

1012786 случае KCA-III, и КС-I:KC-11 2sl s случае КСА-1У (все соотношения по . весу белка), в 0,1 М Фосфатном буФериом растворе (рН 7,0), содержащем

2 М мочевины и 0,5 М хлористого натрия, затем встряхивают в течение

24 ч при 37ОC при этом вещества в соответствующих комбинациях взаимо,действуют друг с другом. Потом эти смешанные растворы концентрируют и подвергают гель-фильтрации на колонке с сефакрилом S-200, уравновешенным

0,1 М Фосфатным буферным раствором (pH 7,0), содержащим 2 М мочевины и

0,5 N хлористого натрия, или ионообменному хроматографическому разделе- 15 нию ассоциированных и неассоцииро.ванных элементарных веществ, получив при этом отдельные ассоциированные вещества КСА-I, КСА-11, KCA-111 и

KCA-lу соответственно. 20

Выходы ассоциированных продуктов сильно изменяются в зависимости от условий обработки и темПературы,РН, времени, плотности и ионных сил.

Обнаружено также, что новые белковые ассоциированные вещества, хотя практически равны по основной активности протеинового комплекса, обладают менее 1/50 лейкоцитозной активности, менее 1/10 активности повышения чув30. ствительности к гистамину, менее

1/25 актигенности и менее 1/3 величи ны БРАЛО по сравнению с соответствующими зйачениями для протеинового комплекса.

35В

Свойства и растворимость элементарных и ассоциированных веществ.

Тонкоизмельченные.порошки всех обессоленных и высушенных при темпе4 ратуре ниже точки замерзания элементарных и ассоциированных веществ 40 являются порошками, которые не расплываются на влажном воздухе (из-за гигроскопичности). КС-III, KCA-11 и КСА-III растворимы в воде в количествах до 1 мг/мл при комнат- 45 ной температуре, тогда как другие плохо растворяются в воде, но растворяются до 4 мг/мл в 0,1 М фосфатном буферном растворе, содержащем

4 М мочевины и 0,5 М NaCQ. 50

Водные растворы указанных веществ становятся мутно-белыми и образуют осадок, когда к ним добавляют суль,Фат аммония, сухой лед с ацетоном, этанол, трихлоруксусную кислоту или 55 аналогичные соединения при 4оС.

Та бл и ц а.2

Компоненты, вес.Ъ.

Составы

Белок Глюцид

1,3+0,4

1,3+0,3

1,5+0,6

li3+0i3

КС-I

КС-11

КС-III

КСА-1

KCA-11

KCA-11I

KCA-1У

96

1 3+0 4

1,3 0,2

1,3+0,3

95

Состав аминокислот белковой составляющей и процентное содержание композиции (мкМ/100 мкМ) приведены в табл. 3.

Таблица 3

Содержание компонентов в составах

КС-1I KC-II I

° ею в.Компоненты

КС-I

9,3

8,1

5 3

8,5

7,7

4,8

Аспарагиновая кислота (Асп)

Треонин (Тр) Каждое из веществ, помещенное в сме- шанный раствор воды и хлороформа или

Н-бутанола, собирается вокруг поверхности раздела обеих жидкостей.

Молекулярный вес соответствующих элементарных веществ, определенных гель-фильтрацией на колонке (1,5х

95 см), заполненной сефакрилом

S-200, уравновешенным 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины и 0,5 М

NaCC, следующий: КС-I, 63000+5200

КС-II 31000g4500) КС-Ill 12500+1500, Молекулярный вес соответствующих ассоциированных веществ, как было определено с помощью колонки (1,5x

95 см), заполненной сефакрилом

S-200, уравновешенным 0,1 М Фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 4 M мочевины и 0,5 М

БаСК, следующий: KCA-1 75000+8500

KCA-11 35000+4500; KCA-111 85000т.

13000, KCA-IУ 88000+6.300 °

Изоэлектрические точки рН соответствующих веществ, измеренные при помощи методики электрофокусировки акриламидного геля, следующие: КС-1

5,6+0,3; КС-11 5,4+0,4; КС-111

8,3+0,3; KCA-I, 6,8+0,4; KCA-ll 6,3

0,3; КСА-111 .8,2 0,5; КСА-lу 5,6+0,4.

В табл, 2 представлены составы протеинового комплекса.

1012786

Продолжение табл. 3

Содержание компонентов в составах

I . 1

Компоненты

КС-1 КС-11 КС-X1T

7,9 9,8

Серии (Сер) 6,2

Глутаминовая кислота (Глу) 9,6

9,6 11,8

4,6

Пролин (Про)

Глицин (Гли)

Аланин (Ала) 5,0

9,3

10i0 9,8

8,1

9,5

11,3

9,3

1/2 цистин (1/2 Цис) 1,1 НД

2,3

10i2

6,2

Валин (Вал) 7,4

Метионин (Мет) 1,8

1,9

6,0

Изолейцин (Иле)

Лейцин (Лей )

Тирозин (Тир)

Фенилаланин (Фен)

Лизин (Лиз)

Гистидин (Гист)

Аргинин (Арг) 4,0

4.,5

2,2

6,5

5,3

8,6

7,6

6,2

2,5

2,8

2,5

4,5

-2,1

1,9

5,8

1,6

0,5

5,4

7,3

4,8

Таблица 4 оличество

1,0

0 5

Полипептон, г

2 ° 5

П р и.м е р 1. Получение и очистка протеинового комплекса.

Высушенные при температуре ниже точки измерения и хранившиеся бактерии Bordete08à pertussis штамм

Маепо 1 фазы культивируют н чашках в среде Bordet-gengon при 37оС 2 дня, потом платиновую петлю с культурой указанной бактерии инокулируют во 45 встряхиваемую колбу емкостью 500 мл, в которой было 200 мл ионообменной смолы, с добавкой модифицированной среды Cohen Whee). er (CW-среда), сос-. тав которой указан в табл. 4, а за" 50 тем встряхивают зту культуру 20-22 ч . при 37О С . Концентрацию бак терий в растворе культуры определяют с помощью спектрофотометра (длина волны

650 нм), и этот раствор добавляют в двухлитровую встряхиваемую колбу, в которую вводят 1 л ионообменной смолы с добавкой CW-среды, таким образом, что окончательная концентра- ция бактерий приблизительно 0,1х

109 клеток/мл, после чего встряхивание культуры продолжают 48 ч (частота встряхиваний 97 раз/мин при 37 С). йикологические свойства вышеуказанного штамма соответствуют данным для штамма бактерий коклюша Т стадии 65

Состав модифицированной среды

Казаминовая кислота, г дрожжевой экстракт, г

Первичный кислый фосфорнокислый калий, г

Растворимый крахмал, г

0,5%-ный раствор сульфата меди, мл

1%-ный раствор хлористого кальция, мл

4Ъ-ный раствор хлористого магния, мл

1%-ный раствор цистина, мп

9 1012786..Продолжение табл. 4

2,5

Хлористый натрий, r

При и с поль з ов анин моди фициров анной жидкой среды ее добавляют с дистиллированной водой, доведя полное. количество до 1000 мл и после установления рН 7,2 203-ным раствором

NaOH к раствору среды добавляют еще

3 r анионообменной смолы (Dialon

SA-20 AP, Mit-sublshl Kasei Со), а затем подвергают стерилизации паром высокого давления при 121 С 15 мин.

Полу енный в результате 48-часо- 20 вого встряхивания раствор культуры нагревают при 56 С 30 мин, а затем центрифугируют (15000 об/мин) при

4 С для того, чтобы разделить надосадочную жидкость и клетки бактерий. 25

Полученную таким образом надосадочную жидкость из раствора культуры используют в качестве исходного материала для очистки и выдерения целевого протеинового комплекса. 30

10 л полученной таким образом надосадочной жидкости после установления рН 6,0 с помощью 1 н, НСР пропускают через колонку (2,5х4 cM), заполненную оксиапатитом при скорости . З56 потока 200 мл/ч в качестве первой стадии очистки.

0,5Ъ-ный раствор суль-фата железа, мл 1

Большая часть белка проходит че-, рез колонку, не абсорбируясь на ней.

Концентрация белка, определенная 40 по методу Лоури, приведена в табл. 5.

Для определения абсорбированного вещества колонку промывают вначале

0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0), а затем, после повышения 45 молярной концентрации Фосфатного буферного раствора до 0,1 при рН 7,0, абсорбированные белки эффективно элюируют из колонки. Однако при этих условиях протеиновый комплекс из колонки не был элюирован. Поэтому проводят дополнительное элюирование фосфатным буферным раствором той же композиции, но содержащим 0,5 М ИаСР.

В этих условиях целевой протеиновый комплекс удается выделить с высокой степенью активности в соответствии с элюированным белком.

Полученный таким образом протеиновый комплекс концентрируют и после помещения его в мембрану для диализа 60 с максимальной проницаемостью для мол. веса 8000, дважды подвергают диалиэу (в течение 12 ч) с дистилли рованной водой и дважды (в течение

l2 ч) с 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Для дальнейшей .очистки раствор, ссдержащий протеиновый комплекс, пропускают через колонку (1,5х10 см), заполненную карбоксиметилсефаровой Cf 6В, уравновешенной 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Материал, который не был абсорбирован в этой колонке, не обладает активностью. После повышения молярной концентрации к рН фосфатного буферного раствора до величин 0,1 и 7,0 соответственно проводят аналогичное элюирование, добавив 0,5 М физиологического раствора, после чего получают протеино- . вый комплекс в соответствии с элюиро|ванным белком.

Так как при определении методом дискового электрофореза полученный продукт еще содержит небольшое количество примесей, этот протеиновый комплекс концентрируют далее и, после помещения в мембрану для диализа, дважды подвергают диализу (всего в течение 12 ч) с дистиллированной водой и дважды (всего в течение 12 ч) с 0,01 М Фосфатным буферным раствором (рН 7,0). Полученный после диализа образец пропускают через КолонкУ (1,5 ° 8 см), заполненную Соп A-сефарозой 4В, которую уравновешивают

0,01 М фосфатным буферным раствором (рн 7,0) .

При обработке тем же буферным раствором злюируют следовые количест- ва белка, однако эта белковая фракция не обладает активностью. При дальнейшем элюировании 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,5 М NaC0, получают протеиновый комплекс в соответствии с элюированным белком.

Так как эта порция белка еще содержит мельчайшее количество примесей при определении с помощью дискового электрофореза, ее собирают, концентрируют и подвергают диализу с- 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,5 M НаСЮ .

-Образец после диализа подвергают гель-фильтрации на колонке (2,8

360 см), заполненной биогелем P-100, уравновешенным тем же буферным раствором. В результате получают чистый активный фактор, соответствующий белковой фракции, дающей пик молекулярного веса около 80000.

Эффективность выделения, очистки и другие. данные, полученные на этой стадии очистки, приведены в табл. 5.

1012786

Таблица 5

Очистка

Стадия .

Количество раствора, мл

Активный выход, %

Концентрация белка, мк г/мл

Удельная активность ед/мкг

10000 ?300

0,84

100

130

759

160

904

52

1 005

210

1196

50

1217

164

1449

1342

158

1598

Таблица 6

0,5

Надосадочная жидкость культурной среды

Хроматографическая.колонка с оксиапатитом

Хроматографическая колонка с СМ-сефарозой

Хроматографическая колонка с Соп А-сефарозой

Хроматографическая колонка с биогелем P-100

В качестве стандарта используют коровий сывороточный альбумнн.

Чистоту вещества ойределяют в соответствии с данными дискового электрофореза на полиакриламидном геле (концентрация полиакриламида

7,5%, 1 н.КОН " ледяная уксусная кислота в качестве буферного раство ра (рН 4,3 ) °

Количество образца на гель составляет 30 мкг (в виде белка). Эксперимент проводят, подавая ток 4 мА в течение 2 ч, проявляя амидочерным

10 В и обесцвечнвая 7%-ным раствором З5 уксусной кислоты.

Образец, полученный на этой -конечной стадии, является отдельньм веществом, практически свободным от примесей, и стимулирующая секреция 40 инсулина. хорошо согласуется с активностью для этого выделенного вещества. Для определения структуры субъединицы этого вещества его подвергают затем дисковому электрофорезу с. SDS 45 (додецилсульфат ;натрия) в соответствии с методикой Шапило.

50 мкг пробы вещества (в расчете на белок) добавляют к смеси 1% SDS, 1% меркаптоэтанола и 4 М мочевины.

После 2 ч инкубирования при 37 С полученную смесь наносят на 10%-ный. полиакриламидный гель, содержащий

1% SDS, затем 4 ч пропускают ток

8 мА/гель, пРоявляют Соощз1е голубым 55 и обесцвечивают 7,5 уксусной кисло той. Полученные результаты приведены. в табл.9.

Высушенные при температуре ниже точки замерзания и хранившиеся бактерии коклюша Вогде еИа стадии 1, 0 штамма Tohama культивируют в среде

Bordet gendon (B9-среда), содержащей

20% дефибринизированной лошадиной крови, при 37ОС 3 дня, потом в тече ние 20-24 ч культивируют в В ско- 65 шенной среде при 37ОC а затем платановую петлю культуры бактерий инокулируют в 500-миллиметровую встряхиваемую колбу, в которую предварительно помещают 200 мл ионообменной смолы, к которой добавляют полусин- . теткческую жидкую питательную среду (модифицированная среда Cohen Wheeler) состав которой приведен в табл. 6, после чего культуру встряхивают в течение 20-24 ч при 37 С.

Концентрацию бактерий в растворе культуры определяют с помощью спектрофотометра (длина волны 650 нм)., и полученный раствор добавляют в двухлитровую встряхиваемую колбу, в которую перед этим помещают 1 л указанной C_#_-среды,.так что окончательная концентрация бактерий достигает

0,07 до 0,15 ° 10 клеток/мл. После этого культуру встряхивают в течение

4 ч при 37 С (частота встряхивания

100-120 раз/мин) . Полученный таким образом встряхиваемый раствор нагревают при 56 С 30 мин, затем центрифугируют (со скоростью 15000 об/мин) при 4 С для того,.чтобы отделить надосадочную жидкость от клеток бак терий.Состав модифицированной Количество среды

Казаминовая кислота, r

Дрожжевой экстракт, r

Первичный кислый фосфорнокислый калий, г

Растворимый крахмал, г

0,5%-ный раствор сульфата меди, мл

14

1012786

13 боксиметилсефарозой СЬ-6В, уравновешенной тем же самым буферным раствором, что и ранее. Тот материал, который не был абсорбирован в колонке, не обладает активностью. После повышения молярной концентрации и рН фосфатного буферного раствора до

О, 1 M и 7, 0 соответственно проводят аналогичную обработку, добавив 0,5 М хлористого натрия, и получают про10 теиновый комплекс, соответствующий элюированному блоку. Этот протеиновый комплекс концентрируют до 10 мл и подвергают диализу 4 раза за 24 ч с 2 л дистиллированной воды, после чего проводят 4-кратный диализ в течение 24 ч в равновесии с 1 л 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 4,5 раствора, содержащего 0,1 М хлористого натрия, или рН 4,5 при содержан нии О 1 М литийхлорид — соляная кислота) . Этот раствор пропускают со скоростью 5 мл/ч через колонку (1,2 ° 8 см), заполненную P-ацетоксимеркуранилин-сефарозой 6МВ, уравновешенной указанным буферным раствором, с последующей тщательной. промывкой им (около 200 мл) . Абсорбированный материал элюируют тем же буферным раствором, в который добавляют 0,01 М 2 -цистина. В неабсорбированной фракции нет протеинового комплекса, весь он в окончательном элюате. Этот протеиновый комплекс шесть раз подвергают диализу в течение 48 ч с 2 л дистиллированной воды, 3 .высушивают при температуре ниже точки замерзания,в результате чего получают 7,3 мг светло-коричневого порошка. Полученный продукт дает отдельную полосу при электрофорезе

4() на полиакриламидном геле (использу.ется гель с рН 4,3) а его изозлектрическая точка рН составляет 7,8+0,5.

Продукт содержит, вес.%: белок около 92, глюцид 1,8-5,6 и липиды 0-2.

Молекулярный вес этого вещества по данным гель-фильтрации (с использованием биогеля P-150 на колонке разме-, ром 1, 8 ° 95 см и 0,01 М ацетатным буферным раствором с рН 4,5) 51000

4300.

В табл. 7 представлен состав аминокислот полученного продукта.

Продолжение табл. 6

1%-ный раствор хлористого кальция, мл 4%-ный раствор хлористого магния, мл

Полипептон, r

1%-ный раствор цисти.на, мл

2,5

0,5%-ный раствор сульфата железа, мл

Хлористый натрий, r

2,5

При использовании этой жидкой среды ее разбавляют дистиллированной водой до получения общего количест- . ва 1000 мл, и после установления величины рН 7,2 с помощью 20%- ного раствора NaOH к ней еще добавляют

3 г анионообменной смолы (Диаион

A-20AP), после чего стерилизуют 1520 мин паром высокого давления пци

121 С.

10 л полученной таким образом надосадочной жидкости культурной среды пропускают через колонку (5 2 см, скорость потока 60 мп/ч), заполненную оксиапатитом, промывают 100 мл

0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 6,0). После этого колонку промывают 300 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0), и 0,1 M фосфатным буферным раствором (рН 7,0) содержащим 0,5 М хлористого натрия, со скоростью 15 мл/ч для элюирования целевого активного фактора. Полученный таким образом протеиновый комплекс концентрируют. до 15 мл с полиэтиленгликолем (средний мол.вес

20000) и подвергают диализу четыре раза за 24 ч с 2 л дистиллированной воды, затем еще четыре раза подвергают диализу за 24 ч с 1 л 0,01 M фосфатного буферного раствора (рН 6,0) до равновесия. Затем полученный продукт пропускают через колонку (1,5 ° 10 см), заполненную кар

Таблица 7

Коли72 7,3 75 10,0 65 75 6,5 34 5 1,7 6,9 тво

П р и м е ч а н и е. Гидролиз в 6 н. НС при 110 С в течение 16 ч, КомпоАсп Тр Сер Глу Про Гли Ала Цис/2 Вел Mem Ил Лей Тир Фе Лиз Гис Арг ты

1012786

Эффективность выделения, чистота занной окончательной стадии, привеи другие данные, полученные на ука- дены в табл. 8.

Т а б л и ц а 8

Выход, Очистка

Раствор, Концентмл рация белка, г/мл

Удельная активность

Стадии

Пол-. ное содержание белка, мл

Надосадочная жидкость культурной среды 10000 3500

35000 0,56 100 1

Хроматографическая колонка е оксиапатитом

24,3 647,3 80,3 1155,9

270

Хроматографическая колонка с СМ-сефарозой

235i9 12с5 862 ю0 55s0 1539 r3

Хроматографнческая колонка с PANA-сефарозой

112,3 7,3 1349,0 50,2 2408,9

Стимулирующая секрецию инсулина активность составляет 1,349 О мкг, а ZS острая токсичность LD 0 232 мкг/кг для самцов мышей и 174 мкг/кг для мышей-самок.

Пример 2. Получение и очистка компонентов.

1 . 20 мг очищенного протеинового комплекса, стимулирующего секрецию инсулина, растворяют в 3 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора (рй 7,0), содержащего 8 N мочевины и 0,5 М хлористого натрия, и после выстаивания смеси в течение 2 ч при

37ОС ее подвергают гель-фильтрации на колонке (1,5 95 см), заполненной сефакрилом S-200, уравновешенной укаэанным буферным раствором. Таким 40 способом протеиновый комплекс разделяют на три компонента с различным молекулярным весом (KC-I КС-II u

КС-III в порядке возрастания молекулярного веса). Для того, чтобы про-45 вести дальнейшую очистку этих компонентов, их фракции собирают, концентрируют и снова подвергают гельфильтрации на той же колонке.

2. 20 мг очищенного протеинового 50 комплекса, стимулирующего секрецию инсулина, растворяют в 3 мл 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 8,5), содержащего 8 M мочевины, и после выстаивания смеси в течение

2 ч при 37ОС его пропускают через колонку (1,5 ° 20 см), заполненную

ДЕЛЕ-целлюлозой, уравновешенную указанным буферным раствором. КС-III проходит через колонку, не абсорбируясь на ней, а КС-1 и KC-1I абсор- 60 бируются в колонке. KC-I элюируют

0,02 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины, а КС-II — 0,05 М фосфатным буфером (рН 6,0). Для дальнейшей очистки 65 этих материалов, их концентрируют и затем подвергают гельфильтрации на колонке (1,5 95 см), заполненной сефакрилом S-200, уравновешенной

0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины и 0,5 М хлористого натрия. KC-I имеет две

1:1 подгруппы на высокомолекулярной стороне протеинового комплекса, КС-II соответствует подгруппе промежуточного молекулярного веса протеинового комплекса, а KC-III — подгруппе низкого молекулярного веса.

Пример 3. Получение и очистка компонентов.

Компоненты КС-1, КС-1I и КС-III полученные в примере 2, ассоциируют в соответствующих сочетаниях, в результате чего получают новые компоненты, стимулирующие секрецию инсулина под названием KCA — 1 (ассоциация

КС-1 и КС-III) KCA-Il (ассоциация

KC-IT u KC-I1I), KCA-I1T (ассоциация

КС-Ii КС-IT и КС-111) и КСА-1У (ассоциация КС-1 и КС-II) .

Оптимальные условия получения этих веществ KCA-1, KCA-11, KCA-III и KCA-1У следующие. В случае KCA-1

КС-1 и KC-III смешивают в соотношении 5:1 в водном растворе и после установления рН 7,0 полученную смесь встряхивают при 37 С в течение более

24 ч ° Для получения KCA-11 — КС-1I и KC-111 смешивают в соотношении

2:1 и после установления рН 7,0 полученную смесь встряхивают при 37ОС в течение более 1 ч.- Для получения

KCA-III - КС-I,.ÊÑ-II и КС-III смешивают в соотношении (в расчете на протеин) 5:2".2, устанавливают величину рН 7,0 и в течение 24 ч встряхивают при 37 С, для получения

KCA-IУ вЂ” КС-1 и КС-IT смешивают в соотношении 2:1, затем устанавливают, 1012786, 18

Стимулирующая секреция инсулина, ед

Доза, мкг/кр са

Доза, мкг/крыса

Веществ отенциальная ммуноактивность, ед

299 0,25

1АР«

4096

10

10

КС-1 рН 7,0 и встряхивают в течение 24 ч при 37 С.

В указанных условиях все эти вещества можно получить с выходом более 95%, однако для того, чтобы исключить неассоциированные вещества, полученные продукты подвергают далее гель-фильтрации через колонку (1 5. 95 см), заполненную сефакрилом

S-200, уравновешенную 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), со- 1О держащим 2 М мочевины и 0,5 М хлористого натрия. Полученные таким способом компоненты проявляются при дисковом электрофорезе как отдельные соединения. !5

Пример 4. Фармакологическое действие.

1. Определение стимулирующей секреции инсулина.

Стимулирующую секрецию инсулина каждого из компонентов можно определить, измеряя реакцию животных на различные типы стимуляторов секре« ции инсулина, обычно для этих целей в качестве стимулятора выбиРают глю- 25 козу. Используют самцов крыс Wistar (весом 130-140 r).

Тестовая методика.

Компоненты различной силы растворяют в физиологическом соляном

:растворе и по 0,2 мл каждого из этих растворов вводят внутривенно при анестезии эфиром в бедренную вену подопытных крыс . Через три дня определяют стимулирующую секрецию инсулина для каждого из веществ. Перед экспериментом крысы голодают 18-20 ч.

Для определения стимулирующей секреции из хвостовой вены каждой крысы отбирают 0,1 мл крови, сразу после этого осуществляют внутрибрюшинную 40 инъекцию ЗОЪ-ного раствора глюкозы в количестве 1 мл на 100 r веса, и через 15 мин снова таким же способом отбирают 0,1 мл крови. Стимулирующую секрецию инсулина определяют по раз- 4 / нице в уровне содержания сахара в крови и концентрации инсулина в крови до и после введения глюкозы. Уровень сахара в крови определяют по методу глюкозооксидазы в концентрацию gp инсулина по двойному методу антител.

Потенциальную иммуноактивность компонентов можно определить с помощью различных экспериментальных систем.

Тестовые животные: самки крыс штамма Wistar.(âåñ тела 200+10 г) и самцы крыс штамма Wistar (вес тела

250 20 г) .

Тестовая методика заключается в следующем. Динитрофенил-аскарис (ДИФ-AC), полученный при связывании нитрофенильной группы с протеином, полученным из Ascaris suum, используют в качестве антигена. 1 мл такого антигена и различные активные вещества растворяют в 0,5 мл физиологического раствора, полученные таким образом растворы вводят подкожно в подошвы как передних, так и задних ,конечностей самцов крыс, находящихся под эфирной анестезией, для первичной иммунизации. Для контроля 1 мг ДНФ-AC растворяют в 0,5 мл физиологического раствора, содержащего 10" погибших клеток бактерий. В.pertussis и аналогичным образом сенсибилизируют для осуществления первичной иьжунизации.

Через 5 дней после первичной иммунизации 0,5 мп физиологического раствора, содержащего 0,5 мг ДНФ-АС, вводят в спинную мышцу крыс под эфирной анестезией, и erne через 3 дня определяют уровень содержания антител анти-ДНФ-АС в сыворотке. Это определение проводят следующим образом. 0,1 мл крови, полученной из хвостовой вены крысы, помещают в тестовую пробирку с 0,2 мл физиологического раствора, содержащего гепарин, и после разделения на центрифуге при скорости вращения 3000 об/мин при 4 С в течение 15 мин выделяют надосадочную жидкость для приготовления пятикратно разбавленной сыворотки. Уровень содержания антител в полученной таким образом сыворотке определяют, используя пассивную кожную анафилактическую реакцию по методу Тапа. Уровень содержания антител в сыворотке выражают через максималь-, ное разбавление сыворотки, при котором появляются синие пятна более

5 мм, а активность промотирования выделения антител (силу) каждого препарата выражают в единицах активности, причем активность, соответствующую 10 »-24-кратному уровню антител, обозначают как 1000 единиц. Удельную активность определяют путем деления единицы силы на вес. !

Стимулирующая секреция инсулина и потенциальная имиуноактивность представлены в табл. 9, таблица 9

I0l2786

Продолжение табл. 9

KC-111

KCA-1

КСА-11

КСА-111

KCA-IУ

1263

1383

1200

1024

1024

512

Ф

1AP — протеиновый комплекс, Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, выделенный и очищенный в соответствии с изобре.тением, не только действует как сти- 70 мулирующий секрецию инсулина агент у млекопитающих и поддерживающий уровень сахара в крови в нормальных пределах, но также пригоден для стимуляции выделения антител и для по- 25 вышения клеточной иммунности . Поскольку этот протеиновый комплекс оказывает указанные действия в черезвйчайно малых дозах, его можно использовать как лечебный или профилак-30 тический препарат для различного рода диабетов, нли в качестве лечебного препарата против заболеваний, возникающих в результате нарушенных иммунофункций (например, злокачественные опухоли, апластическая ане мия, ревматоидные артриты и т .д;) .

Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, его составные компоненты КС-Х, КС-11 и KC-III u ассоциированные из них вещества. 40

КСА-I, KCA-II, KCA-III u KCA-1У обладают активностью по отношению к стимулирующей секреции инсулина и потенциальной иммуноактивностью, Компоненты протеинового комплекса,45 каждый в отдельности, обладают слабой стимулирующей активностью секреции инсулина, а при соединении друг с другом — высокой активностью. В частности все без исключения ве50 щества, включающие КС-III обладают высокой стимулирующей секрецией инсулина, поэтому именно этот компонент

КС-III играет важную роль в развитии стимулирующей секреции инсулина.

Побочные эффекты и токсичность.

Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, выделенный и очищенный, обладает высокой стимулирующей активностью секреции инсулина в черезвычайно малых дозах и поэтому может быть с высокой эффективностью использован для лечения и предотвра" щения различных видов диабетов. Однако этот протеиновый комплекс обладает также целым рядом побочных эффектов, 65 стимулирующий секрецию инсулина. таких как п