Способ получения арилламинариолигозидов

Способ получения арилламинариолигозидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОКИ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК, SU;„,1013474

С 12 Р 19/12; С 12 P 19/!8

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

4 44TOPCHOMV CCNJICTCOOCTOV

es,©И фааа1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

fI0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪЙ (21) 3304250/28-13

$22) 28.05.81 (46) 23.04.83. Б . К 15 (72) Н, И. Назарова, Л. А. Елякова и Т. Н. Звягинцева (71) Тихоокеанский институт биоорганическрй химии Дальневосточного научного центра АН СССР (53) 577.15.07{088.8) (54) 1. Такео К. "Carbohydr. Res.", 1979, 77, 245-25-. 2. Sova V. V., Elyakova 1 ..%., Vas:lovsky V. Е. Purification and some

:р operties of )-1,3-glucin-glucano, hy4rolase from the crystalline style

of bivalvia spisula sachalinensis", ВВА, 1970, 212, Ц3.-115.

- 3. Wallenfels К. et al. "Carbohydr. Res", 1978, 61, 359-368. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРИЛЛАИИНАРИОЛИГОЗИДОВ общей формулы где R - глюкоза, ламинарибиоза, ламинаритриоза, ламинаритетраоза;

Аг - арил, выбранный из группы, включающей п-нитрофенил, нафтил, о-нитрофенил, фенил, 4-метилумбеллиферил, о-т л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса, смесь peal 3-глюкана и арилглюкозида, где арил имеет указанные значения, подвергают воздействию эндо-р 1,3-глюканазы из Spusula sachalinensis в

0,05 И буферном растворе при рН 5,25,4 в течение 4-24 ч с последующим хроматографическим разделением полу,.ченных продуктов.

2. Способ по и. 1 о т л и ч а ешийся тем, что процесс ведут при концентрации р -1,3-глюкана .. Я

15-20 мг/мл и арилглюкозида- 25- вы

-30 мгlмл реакционной смеси и актив- . (")

- ности фермента 0,75-1,5 Е/мл реакционной смеси. М

990

1013474

Изобретение относится к биооргвнической химии, а именно к химии углеводов и их производных, и касается способа получения арилламинариолигозидов.

Арилгликозиды и -олигозиды находят применение в научных целях как модельные соединения, Арилолигозиды используют в качестве субстратов для установления структуры углеводсодер10 . жащих биополимеров - в качестве свидетелей продуктов их взаимодействия с различными классами соединений. Одним из основных стимулов развития химии гликозидов является все возрастающий интерес биохимиков к обФ ширному классу низкомолекулярных биорегуляторов - сердечных, тритерпеновых, стероидных гликозидов. Многие арилгликозиды являются биологически активными веществами, Так, природное соединение 2-(и -оксифенил)-этил-р-D-глюкопиранозид — действующее начало широко известного лекарственного средства народной медицины "золотого корня".

Гликозилирование вещества является трудной, но часто необходимой процедурой,. Так, известно, что гликозилирование уменьшает токсичность 30 агликонов (например, сердечных гли козидов) и увеличивает проницаемость веществ через биологические мембраны, Проблема перевода лекарственных веществ в водорастворимое состояние (что можно осуществить с помощью гликозилирования) хорошо известна фармакологам. Путем изменения углеводной компоненты можно управлять процессами транспорта Ьиологически актив- . 40 ных веществ, Большую часть указанных соединений получают путем химического синтеза, однако это почти всегда трудоемкий и многостадийный процесс, 45

Известен способ получения арилламинариолигозидов, который заключается в следующем.

1, Сийтез бензил-3-0-р-0- глюкопиР ранозил-р-0-глюкопиранозида (бензил50

-p-ламинариЬиозида) проводят в несколько стадий: а) конденсацией 2,3,4,6-тетра-О-ацетил D-глюкопиранозилбромида с метил-2-0-бензоил-4,6-0-бензили55 ден-oL- О-глюкопиранозидом в присутствии трифтометансульфоната серебра (катализатор) и 1,1,3,3-тетраметилмочевины в дихлорметане получают

2-0-бе н зоил -4, 6- О-Ьен зили ден-3-0- (2, 3,4,6-тетра-О-ацетил-р-О-глюкопиранозил) -d.- D-глюкопироназид; б) последовательной обработкой полученного продукта метилатом натрия в метаноле, 60 -ной уксусной кислотой, смесью уксусный ангидрид-пиридин, 24 H SO в уксусном ангидриде получают 1,2,4,6-тетра-О-ацетил-3-0-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-Р-О-глюкопиранозил)-о -D-глюкопиранозид;

e) его подвергают бромированию насыщенным раствором kBr в уксусной кислоте при О С; получают ?,3,4-три-О-ацетил-3-0-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-P-О-глюкопиранозил) M-D-глюкопиранозилбромид; г) обработкой которого сухим бензиловым спиртом в присутствии цианис,той ртути получают бензил-2,4,6-три-О-ацетил-3-0-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил+D-глюкопиранозил) -p-0-глюкопиранозид и далее; д) снятием защитных групп (деацетилирование) метилатом натрия в сухом метаноле получают целевой продукт.

2. Фенил-3-О-р-О-глюкопиранозил-15-О-глюкопиранозид (фенил-р -ëàìèíàрибоизид) получают конденсацией 2,3, 4-три-О-ацетил-3-,0- (2,3,4,6-тетра-О-ацетил- -D-глюкопиранозил-аЬО-глюкопиранозил) -с(;0- глюкопиранозилбромида с фенолом в воде в присутствии

K0k, Снятие защитных групп проводят так же, как и при получении бензил-р-ламинарибиозида.

Выходы целевых продуктов от исходных веществ составляют 23-304 (1 j.

Известный способ обладает следующими недостатками : для его осуществления необходимо предварительно получить исходные ламинариолигозиды; способ многостадийный (5 стадий) и трудоемкий, требует использования дорогостоящих, труднодоступных и ядовитых веществ (цианистая ртуть и трифторметансульфонат серебра в качестве катализаторов); требует использования широкого набора органических растворителей и реагентов: этилового спирта, хлороформа, ацетона, фенола, уксусного ангидрида, пиридина, этилацетата, петролейного эфира, бензилового спирта, уксусной кислоты, причем некоторые из них - после дополнительной очистки и абсолютирования; требует многократной перекристаллизации получае13474 4 способностью каталиэировать гидролиз ламинарина. Фермент осуществляет "наращивание" углеводной цепи с образованием гомологов арилламинариолигозидов. Синтез можно представить схематически:

Д + A

1S

0Н

20, где К - глюкоза, ламинарибиоза, ламинаритриоза, ламинаритетраоза;

Аг - арил, выбранный иэ группы, вклюмающей .п-нитрофенил-, нафтил-, о" — нитрофенил, фенил, 4-метилумбеллиферил, смесь р -1,3-глюкана (ламинарин) и арилглюкозида, где арил имее- ука30 ванные значения, подвергают воздействию фермента эндо-)ь-1,3-глюканазы (ламинариназы Л1У) из Spisula

sachal1ïåns1s в 0,05 И буферном растворе при рН 5,2-5,4 в течение 4-24 ч с последующим разделением образующихся в ходе ферментативного синтеза арилламинариолигозидов.с помощью жидкостной хроматографии.

Обычно процесс ведут при концентрации р-1,3-глюкана 15-20 мг/мл и

- арипглюкозида - 25-30 мг/мл реакционной смеси и активности фермента

0,75-1,5 Е/мл реакционной смеси.

Предлагаемый способ основан на трансгликозилирующей способности фермента эндо-р-1,3-глюканазы (ламинариназы Л1У), выделенной из молюска Spisula sachalinens s (2 ).

Ламинзриназа Д1У катализирует син- . тез арилламинариолигозидов из ламина- в рина, используемого в качестве донора, и Аг- Ь-D-глюкопиранозида-акцептора, т.е. в этом .процессе используется трансгликозилирующая активность ламинариназы Л1У (способность SS к переносу гликозильных остатков), которой обладает фермент Л1У, наряду.с гидролитической способностью3 10 мых продуктов на промежуточных ста- диях с целью их очистки; способ требует создания определенных условий реакции. Так, например, синтез бензил-3-0-is-D-глюкопиранозил-1в-D-глюкопиранозида проводится при полном отсутствии влажности, дневного свеТа и т,д °

Целью изобретения является упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения арилламинариолигозидов общей форЕН ОН где Д вЂ” донор — ламинарин;

А - акцептор - арилглюкозид;

П - продукты реакции

Š— фермент..

В качестве акцепторов используют следующие арилглюкоэиды: и-нитрофенил-9-0-глюкопиранозид, 1-нафтил-р-0-глюкопиранозид, фенил- Ъ-D-глюкопираноэид, о-нитрофенил-p-D- .

-глюкопиранозид, 4-метилумбеллифенил-p-D-глюкопиранозид, Выбор условий энзиматического синтеза проводится на основании фиксирования количества и-нитрофено- ла, освобождающегося в результате реакции трансгликозилирования при

"тп,, = 400 пт, Поскольку авторами изобретения было установлено, что и-нитрофенол не отщепляется от самого акцептора (контрольный опыт

Л1У+и-нитрофенилглюкозид показал это), то появление его в инкубационной смеси связано с синтезом фермен том и-нитрофенилпроизводных олигомеров, и является следствием обратного процесса их вторичного расщепле" ния как субстратов. Таким образом, количество выделившегося и-нитрофенола может свидетельствовать об интенсивности протекания реакции. На фиг. 1-3 приведены графики зависимос-. ти количества выделившегося и-нитрофенола от концентрации фермента (фиг. 1), акцептора (фиг. 2) и донора (фиг. 3g.

Оптимальными концентрациями для протекания ферментативного синтеза на основании приведенных графиков были выбраны: для фермента — 0,3 мл в.

2 мл инкубационной смеси, что составляет 1,5 Е активности; для акцептора - 25-30 мг/мп; для донора - 15- .

20 мг/мл.

На фиг. 4 пердставлены хроматограммы продуктов энзиматического синтеза при оптимальных концентрациях исходных компонентов и разном-времени инкубации: 1 ч, 4 ч, 24 ч и 48 ч.

Как видно, время инкубации 1 ч недосТ а б л и ц а 1

Пр.оду кты реакции, 4

Время инкубации, ч

1 4

Т

24 и-Нитрофенилламинарибиозид

19,3

19,8

6.7

12,4 и-Нитрофенилламинаритриозид

8,1

11,3

4,0

9,9 и-Нитрофвнилламинаритетраозид

8,6

4,6

5,0

3,7

S 1013 таточно, так как при сравнении с последующими хроматограммами наблюдаем увеличение количества продуктов синтеза. Инкубация же свыше 24 и, например 48 ч приводит к исчезновеф: s нию высших олигомеров (заметно сказывается обратный процесс расщепления).

Эндо-р-l,3-глюканаэа (ламинариназа Л1У) работает в интервале рН 5,2- to

5,4 в 0,05 И ацетатном буфере. Ферментативный синтез протекает при комнатной температуре.

Подробное описание синтеза, выделения и идентификации целевых ве- 1З ществ дается на примере способа полученйя и-нитрофенилламинариолигозидов (пример 1). Синтез других арил.-. ламинариолигозидов проводят аналогич- но описываемому в примере 1 и поэто- 20 му Он приведен в последующих примерах без подробного описания процесса.

На фиг. 5-10 представлены хроматограммы, отражающие ферментативный 25 синтез арилламинариолигоэидов.

Пример 1. Ферментативный синтез п-нитрофенилламинарибиозида, -ламинаритриозида и -ламинаритетраозид а. ЗФ

450 мг ламинарина и 750 мг и-нитрофенилглюкоэида растворяют в 30. мл

0,05 Н йа-ацетатного буфера,- рН 5,3.

В этот раствор добавляют 0,75 мл эндо-1,3-глюканазы из моллюска Spi.su1а sachalinensis (ламинаринаэа Л1У) и инкубируют при 22-25 С 24 ч, если необходимо получить смесь с преоблада- 4O ющим содержанием и-нитрофенилламинарибиозида и и-нитрофенилламинарит474 d риоэида фиг. 5 или кривая иа фиг. 4) . С целью получения относительно больших количеств и-нитрофенилламинаритетраоэида, смесь инкубируют 4 ч (фиг. 6, или кривая ---- на фиг ° 4) .Продукты синтеза анализировали с помощью жидкостного углеводородного хроматографа jeol (модель )1.С-6АН). В аналитическом варианте анализ инкубационной смеси на биогеле П-2 (100х0,9 см скорость эдюции 7,8 мп/ч, t = 55 C) представляет собой следующую картину (фи4 . 5): пики 1,2,3,4 и т.д. со свидетелями идентифицированы соответственно как глюкоза, ламинарибиоза, триоэа, -татраоза и т.д. Пик 1 был идентифицирован со свидетелем как и-нитрофенилглюкозид. По аналогии с разделением продуктов реакции инитрофенилмальтоолигозидов, достигнутым..в работе (3 ), где эти гомологи мальтооолигозидов разделяли аналогично жидкостной хроматографией на биогеле P-2, пики П, Ш, Й принадлежат соответственно и-нитрофе . нилламинарибиозиду, -триозиду и тет-. раоэиду. (доказательство - в разделе "Идентификация продуктов").

Смесь, содержащую набор продуктов ферментативного синтеза, разделяют на препаративной колонке на биогеле П-6 (100х3,3 см, t колонки

=60 С, скорость элюции 30 мп/ч) на две фракции: ламинариолигосахариды и п-нитрофенилламинариолигозиды.

Фракцию h-нитрофенилламинариолигоэидов лиофильно высушивают и идентифицируют содержащиеся в ней вещества. Выход индивидуальных компонентов, в пересчете на исходный..ламинарин приведен в табл. 1.

474 8

Идентификация продуктов энзиматического синтеза.

Идентификацию продуктов проводили несколькими способами:

a). Препаративно выделенные продукты - смесь и-нитрофенилламинариолигозидов пики t- ф, фиг. 5) - с целью установления их структуры подвергли ферментативному гидролиэу 3-глюкозидазой иэ сладкого миндаля (время инкубации - 9 ч, й=25oC).

На фиг. 11 представлены хроматограммы инкубационной смеси до и после действия р -глюкозидазы (скорость расщепления коротких субстратов,наивысшая для этого фермента).

Отсутствие на хроматограмме пиxa ll-à-нитрофенилбиозида, уменьшение пика g -и-нитрофенилбиозида и по-. явление значительного колйчества выделенной глюкозы, а также увеличение в продуктах ферментативного гидролиза свободного и-нитрофенола (увеличение оптической плотности и-нитрофенола наблюдали по увеличению интенсивности скрашивания пробы в щелочной среме при я „=400 пт), Все это подтверждает, что синтезированные продукты (пики II, И1 и IY) содержат и-нитрофенольные радикалы, соединенные р-связью с глюкоэными единицами, т.е. все полученные веществ являются р -глюкозидами; б) . Инкубация смеси продуктов реакции (1- 1У) с экзоламинариназой ЛП (экэо-Р-1,3-глюканаэой, выделенной из Euiota moaki, специфичность кото рой установлена: фермент способен гидролизовать р3,3-связи в - р-1,3-глюканах и р -1,3-глюкоолигозидах, освобождая последовательно остатки -глюкозы с невосстанавливающих концов молекул субстрата; наилучшему расщеплению подвергаются более длинные субстраты). подтверждает наличие р-1,3-связанных глюкозных единиц, т.е.. содержание в составе полученных веществ ll-нитрофенилламинарибиозида, -ламинаритриозида. и -ламинаритетраозида (фиг. 12) ; в) . Фракцию, содержащую и-нитрофенилламинариолигозиды (пики f- ф), лиофильно высушивают. Полученный ЗС-ЯИР-спектр (табл. 2) в сравнении со спектром ламинарина подтверщдает наличие р -1,3-связи между остатками глюкозы и отсутствие других типов гликозидных связей.в данных веществах.

7 - 1013

Препаративное разделение инкубационной смеси с получением индивидуальных целевых компонентов возможно на биогеле П-2 (аналогично фиг. 5 и 6), причем выделенные не- „ прореагировавшие до конца.. n-нитро, фенилглюкоэид и ламинарин можно вновь запускать в последующий синтез. Как видно из табл. 1, с течением времени количество арилламина- 10 риолигозидов, особенно высших, начинает убывать, поскольку они также являются субстратами для .. ламинаринаэы Л1У, и по мере уменьшения концентрации истинного суб- 1Э страта - ламинарина фермент начинает гидролиэовать им же синтезйрованные, более короткие субстраты. Таким образом, варьируя кон центрации исходных веществ, активность фермента либо время инкубации, получают наиболее оптимальные условия производства -арилламинариолигозйдов с достаточно высоким выходом.

П р и м е. р 2. Синтез 1-нафтиллами- нариолигозидов осуществляют аналогично примеру 1, только в качестве:акцептора используют 1-нафтил-р-0-глюкопиранозид (фиг. 7) . Продолжительность - 4 ч.

Выход продуктов составляет, 4:

1-нафтилламинарибиозида 9,1; -триоэида 6,6; -тетраозида 8,9; -пентаозида 5,3.

Пример 3. Синтез о-нитрофенилламинариолигозидов проводят аналогич- З но примеру 1, в качестве акцептора используют о-нитрофенил-/5-0-глюкопи--. ранозид (фиг. 8). Продолжительность4 ч.

Выход продуктов составляет, : о-нитрофенилламинарибиозид 16,63;

-триозид 7,98; -.тетраозид 4,56.

Пример 4. Синтез фенилламинарнолигоэидов проводят rio примеру

1, в качестве акцептора используют фенил-р-0-глюкопиранозид (фиг.9).

Продолжительность - 4 ч.

Выход продуктов составляет, 4; фенилламинарибиозид 2.1,62; . -триозид. 6,67.

Пример 5. Синтез 4-метилум6еллиферилламинариолигозидов; акцептор - 4-метилумбеллиферил-р-0глюкопираноэид. Время инкубации24 ч, И

Выход продуктов составляет, :

4-метилумбеллиферилламинарибиозид

11, 12; триозид 2,42; -тетраозид 2,24

10 .Таблица2!

013474

Химические сдвиги

С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6 J

Ъ, Исследуемые вещества

103, 28 74,13 .85,32 69,30 76,60 61,90

Ламинарии в Д20

Сумма п-нитрофенилолигозидов ! пики 3,-!У) в Д О

104,13 74,13 85,32 69,33 76, го 61,20 ппЮХ„

7.

Ю Мг/мЛ

Использование предлагаемого способа получения арилламинариолигозидов обеспечивает пр сравнению с из; вестным способом следующие преимущества: возможность одновременного получения нескольких арилламинариолигозидов непосредственно из ламинарина (без предварительного получения исходных ламинариолигозидов; ферментативный синтез идет в:одну стадию, в то время как известный способ отличается многостадийностью (5 стадий) и трудоемкостью отдельных процессов;. удается избежать многочисленных операций по упариванию, фильтрации, перекристаллизации и т.д. на промежуточных стадиях, имеющих место в известном способе; спо в .соб не требует использования дорого- . стоящих катализаторов и ядовитых веществ; не требует специально подготовленных органических растворителей; способ не требует специальных услор вий.

10 23474

40 о

0525 1

1013474 час

1 час j

Фиа 7 час

: 1: 63-3474 д vac

Фиг.Я

1013474

Я vac фиа 0 час фиг. 1Г

Составитель О. Скородумова

Техред О.Неце Корректор М. Демчик

Редактор О. Половка

Заказ 2942/34 Тираж 521.

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

-по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное филиал ППП "Патент", r . .Ужгород, ул. Проектная, 4