Способ получения носителя для иммобилизации биологически активных веществ

Способ получения носителя для иммобилизации биологически активных веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

2 А

СОНИ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

<»>SU«»

3(Я) г 08 H 15/06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ, ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTMA (21) 3311847/23-05 (22) 02.07.81 (46) 30.04.83. Бюл. и 16 (72) M.Ê. Клявиньш, И.E. Якобсон и А.А ° Прикулис (71).Латвийский ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет им. П. Стучки (53) 661.728.8(088.8) (56) .1. Авторское свидетельство СССР

Ю 479782, кл. С 08 3 15/06, 1975.

2. Патент ФРГ 11 2247163, кл. 39 Ь1 15/00, 1974 (прототип). (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЯ

ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНИХ ВЕЩЕСТВ обработкой целлюлозного материала бифункциональным агентом, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, в качестве целлюлозного материала используют хлорангидрид карбоксиметилцеллюлозы, в качестве бифункционального агента - 1,б-диаминогексан, и обработку проводят в среде

N„N-диметилформамида 2-5 ч при 80100 С и соотношении хлорангидрида карбоксиметилцеллюлозы, 1,6-диаминогексана и N„N-диметилформамида 1:1:

:10.

1014832, Изобретение относится к синтетической органической химии, в частности к способу получения носителей (сорбентов) для иммобилизации биологически активных веществ, и может быть использовано в ;ферментной про" мышленности для получения биоспецифических сорбентов с целью дальнейшего использования в биоспецифической хроматографии - новом эффективном методе, позволяющем выделять большинство биологически активных веществ с высокой степенью очистки, а также в химической и микробиологи" ческой промышленности и в лаборатор ных исследованиях для очистки и раэ" деления биологических смесей.

Известен способ получения носителя (сорбента) для иммобилизации биологически активных веществ путем обработки целлюлозного материала, например карбоксиметилцеллюлозы, би. функциональными агентами, такими как 1,8-диаминооктан, в присутствии и-толуолсульфоната циклогексйл-fN"

-(N-метилморфолиний)) -этилкарбодиимида (ЦИК) 11.

Основным недостатком данного способа является использование в нем в качестве исходных веществ дорогих и труднодоступных реагентов. Кроме того, длительное вермя протекания реакции (16 ч) препятствует широкому внедрению способа в промышленности.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения носителя (сорбента) обработкой водорастворимого гидразида карбоксиметилцеллюлозы азотистоводородной кислотой при

0-2 С в течение 15 мин с последующим взаимодействием полученного азида карбоксиметилцеллюлозы с диаминами при 0-4 С в течение 10-12©ч (2).

Известный способ предусматривает использование в качестве исходного целлюлозного материала гидразида карбоксиметилцеллюлозы, который возможно получить в 2-х стадийном синтезе в течение 74-76 ч при 40-70оС, что уСложняет и удлиняет процесс получения конечного продукта. Сам же процесс получения носителя протекает также в 2-х стадийном синтезе. 9 первой стадии получают азид карбоксиметилцеллюлозы, который является нестабильным реагентом,. полностью распадается при комнатырй температуре в течение нескольких .часов. Ввиду этого 1-ю стадию синтеза необходимо проводить в течение короткого време ни (до 15 мин) при внешнем охлаждении до 0-2оС. По той же причине нестабильности азида карбоксииетйлцеллюлозы 2-.ю стадию синтеза необходимо проводить сразу же при внешнем охлаждении в течение 10" 12 ч.

Таким образом, по известному спо10

0 собу процесс синтеза сорбента (носителя) для иммобилизации биологичес- ки активных веществ протекает в 4-х стадийном синтезе (включая две стадии синтеза исходного вещества) в

1 течение 88 ч и ввиду своей сложности, длительности и нестабильности приме/ .няемых реагентов. не имеет препаративного значения, Цель изобретения - упрощение и ус20 корение процесса получения носителя (сорбента) для иммобилизации биологически активных веществ.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения носи2 теля (сорбента) для иммобилизации биологически активных веществ обработкой целлюлозного материала бифункциональным агентом, в качестве целлюлозного материала используют хлор30 ангидрид карбоксиметилцеллюлозы, в качестве бифункционального агента1,6-диаминогексан, и обработку проводят в среде N

2-5 ч при 80- 100 С и соотноаении хлорангидрида карбоксиметилцеллюлозы, 1,б-диаминогексана и N N-диметилфорI мамида 1:1:10.

Способ осуществляют следующим образом.

Хлорангидрид порошковои карбоксиме тилцеллюлозы обрабатывают 1,6-диаминогексаном. Использование в качестве целлюлозного материала хлорангидрида порошковой карбоксиметилцеллюлозы, 45 получаемой одностадийным простым синтезом в течение 2-6 ч при 80оС, позволяет значительно упростить и ускорить процесс получения конечного продукта, избежать экстремальных условий проведения синтеза и примене50 ния дорогостоящих реагентов (по известному способу в качестве исходно.го вещества применяют гидразид карбоксиметилцеллюлозы).

На каждые 50 г хлорангидрида карбоксиметилцеллюлозы необходимо 50 r

1,6-диаминогексана. Для ускорения процесса в качестве реакционной среды используют полярный апротонный

3 .1 01 растворитель - N N-диметилшормамид. l

Для оптимизации синтеза процесс проводят при 80-100 С.

Таким образом, весь процесс синтеза, включая получение исходного целлюлозного материала, протекает в 2-х стадийном синтезе в течение

4-11 ч при 80-100 С. Содержание аминогрупп в носителе (сорбенте) колеблется. в пределах 0,08-0,5 ммоль/г сухого. продукта.

Il р и м е р 1. 50 г хлорангидриг да карбоксиметилцеллюпоэы с содержанием хлорангидридных групп

0,12 ммоль/г суспендируют в 500 мл

N„N", диметилформамида, затеи присоедйняют 50 r 1,6-диаминогексана и перемешивают в течение 3 ч при 80 С.

Продукт отфильтровывают, промывают

Н,Н-диметилформамидом, водой, 0,1 н бйкарбонатом натрия, водой, ацетоном, эфиром и сушат на воздухе. Содержание аминогрупп О, 1 ммоль/г.

Соотношение хлорангидрид карбоксиметилцеллюлозы: 1,6-диаминогексан:

Н„Н-.диметилйормамид 1: 1: 10.

Пример 2. 150 г хлорангидрида карбоксиметилцеллюлозы с содержанием хлорангидридных групп

0,12 ммоль/г суспендируют в 1500 мл

iN N-диметипформамида, присоединяют

1 П г 1,6-диаминогексана и перемеюиеают е течение о ч при 80 C. Продукт отфильтровывают, промывают Н Н-диметилформамидом, водой, 0,1 й.бикар= бонатом натрия, водой, ацетоном, эфиром и сушат на воздухе. Содержание аминогрупп 0,1 ммоль/г. Соотношение хлорангидрид карбоксиметилцеллюлозы:

1,6-диаминогексан: N„N-диметилформамид 1:1:10..

Пример 3. 100 г хлорангидрида карбоксиметилцеллюлозы с содержанием хлорангидридных групп

0,12 ммоль/г суспендируют в 1000 мл

Н Н-диметилформамида, присоединяют

100 г 1,6-диаминогексана и перемешивают в течение 2 ч при 90 С. Продукт отфильтровывают, промывают

N„N-диметилформамидом, водой, 0,1 н бикарбонатом натрия, водой, ацетоном, эфиром и сушат на воздухе. Содержание аминогрупп О, 1 ммоль/г. Соотношение хлорангидрид карбоксиметилцеллюлозы: 1,6-диаминогексан: N„N-диметилформамид 1:1:10.

Пример 4. 5 г хлорангидрида карбоксиметилцеллюлозы с содержанием

"832 4 хлорангидридных групп 0,12 ммоль/г суспендируют в 50 мл N„Н-диметилфор-. мамида, присоединяют 5 г 1,6-диаминогексана и перемешивают в течение

2 ч при 100 С. Продукт отфильтровы- 1 о вают, промывают N„N-диметилформамидом, водой, 0,.1 н.бикарбонатом натрия, водой; ацетоном, эфиром и сушат на воздухе. Содержание аминогрупп

0,1 ммоль/г. Соотношение хлорангид5

10! рид карбоксиметилцеллюлозы: 1,6-диаминогексан N„N-диметилформамид

1:1:10.

Пример 5..5 r хлорангидрида . карбоксиметилцеллюлозы с содержанием хпорангидридных групп 0,12 ммоль/r суспендируют в 50 мл N„Н-диметилформамида, затеи присоединяют 2,5 r

1,6-диаминогексана и перемешивают в течение при 80 С. Продукт отфильтровывают, промывают N N-диметилфор1 мамидом, водой, 0,1 н.бикарбонатом натрия, водой, ацетоном, эфиром и сушат на воздухе. Содержание аминод групп 0,06 ммоль/г.

Ro всех приведенных примерах количество исходного материала - хлорангидрида карбоксиметилцеллюлозы приравнивается единице. Оптимальное количество модифицирующего агента—

1,6-диаминогексана, необходимого дпя получения конечного продукта с наибольшим содержанием аминогрупп (т.е. продукта со степенью замещения, соответствующей количественной степени превращения), приравнивается также единице. Оптимальное количество полярного апротонного растворителя при" равнивается к 10. Использование мень40 шего количества растворителя приво- . дит к затвердеванию реакционной сме.си, использование же большего количества растворителя неэффективно, так как выход конечного продукта при этом остается неизменным.

45.Полученные по предлагаемому способу носители (сорбенты) позволяют активно иммобилизоват ь (связыват ь ) биологически активные вещества, что иллюстрируется на следующих примерах.

П р и и е р 6. Иммобипизация производных аминокислот. О, 72 r (0,0025 моль) о-нитро@енилсульфенил-L-лейцина растворяют в 40 мп Н Ч-ди1 - метилформамида и присоединяют 2 г

6-аминогексиламида карбоксиметилцеллюлозы. K этой смеси при перемешивании прибавляют раствор 0,69 r

S 1014832 6 (0,0028 моль ) л-карбэтокси-2 0Kcg (0,07 ммоль/г) определено по содержа1,2-дигидрохинолина в 10 мл И„И-диме- нию фосфора. тилформамида и перемешивают при ком- Применение в качестве исходного йатной температуре в течение 8 ч. вещества хлорангидрида карбоксиметйлПродукт отфильтровывают, промывают 3 целлюлозы, получаемого в одностадийЛ И-диметилформамидом, этанолом, во- ном синтезе и способного в односта 4„ дой, ацетоном, эфиром и сушат На eo3" дийном синтезе взаимодействовать с духе. Содержание аминокислоты диаминами, позвог..:ет Ilo сравнению с (0,04 ммоль/г) определено по содержа известным способом,где в качестве нию серы. реагента используется гидразид кар боксиметилцеллюлозы, получаемый в

Пример 7i Иммобилизация нук- двухстадийном синтезе и способный .леозидфосфатов. Раствор 0,2756 г взаимодействовать с диаминами в двух(0,0005 моль) АТФ (аденозин-5-трифос- стадийном синтезе, ускорить процесс, Форная кислота), окисленный периода- 9 избежать экстремальных условий проветом натрия в 30 мл 0 1 н. ацетатно- дения синтеза и применения дорого-го буфера с рН 5,0 охлаждают до 0 C. стоящих реагентов. о

Присоединяют 5 г 6-аминогексиламида .Таким образом, преимущество карбоксиметилцеллюлозы и выдерживают предлагаемого способа заключается в при ц C при перемешивании в течение >О упрощении и ускорении процесса (син4 ч..Продукт отфильтровывают, промы- тез протекает в две стадии за 2-5 ч, вают 0 1 н."хлоридом натрия, водой, а по известному способу - 4 стадии ацетоном и сушат на воздухе. Содер- за 88 q) и удешевлении конечного про. жанне иммобилизированной АТФ дукта.

Составитель Т. Мартинская

Редактор М. Рачкулинец Техред M° . КоштУРа Корректор О. Билак

Заказ 3126/18 Тираж 494 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11)ОД Москва, Ж-Я Раушская наб. д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул . Проектная, 4