Способ получения иммобилизованной кислой протеиназы
Иллюстрации
Показать всеРеферат
1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИШ1ОБИЛИЗОВАННОЙ КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЫ путем связывания фермента с носителем, о тли ч.аю щ и йс я тем, что, с целью повышения активности получаемого продукта , ферментсодержгиций раствор предварительно подвергают ацилированига хлорангидрндом акриловой или метакриловой кислоты при рН 2,5-4,5 и мольном соотношении фермент: ллорангидрид-ls
СОЮЗ СОВЕТСКИХ.
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ABTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3294211/28-13 (22) 02.06.81 (46) 30.04.83. Бюл. Р 16 (72) Н.А.Платз, В.В.Чупов, Л.И.Валуев, К.А.Калунянц, Г.Л.Кейдун, П.М.Яшнова и Л.A.Íàõàïåòÿí (71) Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена
Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В.Ломоносова и Всесоюзный научно-исследовательский институт Биотехника (53) 577.15.07(088.8) (56) 1. Мотина Л.И., Нахапетян Л.А,, Оптимизация условий иммобилизации кислой протеиназы из Aspergillus awamori Ïðèêëàäíàÿ биохимия и микробиология, 1979, т. 14, 9 3, с, 410-413.
2. Мотина Л.И., Борисова В.Н., Нахапетян Л.A., Иммобилизация кис-. лой протеиназы из.Asperg11Ius awamori на неорганических носителях с карбоксильными группами,- Прикладная биохимия и микробиология, 1981, т. 16, 9 2, с. 212-218. (54).(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЫ путем связывания фермента с носителем, о тл и ч а ю шийсятем, что, с целью повышения активности получаемого про„.SU„„10148S2 A
3(5g С 12 N 9/62У С 12 N ll/08 дукта, ферментсодержащий раствор предварительно подвергают ацилированию хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при рН 2,5-4,5 и мольном соотношении фермент: хлорангидрид-1-. (100-400), а связывание фермента с носителем осуществляют совместной полимеризацией ацилированного фермента с.гидрофильным ненасыценным мономером в присутствии бифункцианального сшивающего агента.
2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве ферментеодержащего раствора используют раствор пектофоетидина П10Х или. его ультраконцентрат.
3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и - Е ч а ю шийся тем, что в качестве гидрофильного мономера используют акриламид или метакриламид или Н-винилпироллидон, а в качестве сшивающего агента иопользуют N,N-метиленбнсакриламид или диэфир метакриловой кисло- ты и этиленгликоля со степенью полимеризации 3 или 13.
4. Способ по пп. 1-3, о т л и— ч а ю щ.и и с я. тем, чтд полимеризацию проводят при концентрации гидрофильного мономера в реакционной смеси 2 5-20 вес.Ъ, а бифункционального сшивающего агента; 0,1-17 вес.Ъ.
1014882
Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к способу получения препаратов иммобилизованной на синтетических полимерах кислой протеиназы, которая широко применяется в пищевой промышленности и медицине, Изобретение может быть использовано для получения высокоактивных стабильных препаратов иммобилизованных кислых протеиааз, Кислая протеиназа (КП) продуциру- 10 ется микроскопическими грибами вида
Aspergillus при их поверхностной культивации. Существует несколько видов этого гриба, способных продуцировать различные типы протеиназ. Наибольший интерес с точки зрения гидролиза высокомолекулярных белков пред" ставляет КП, выделяемая из Aspergillus foetidIIs> Препарат, получаемый на основе этого продуцента, называемый пектофоетидином П10Х, содержит смесь ферментов, в том числе и КП.
Эта протеиназа стабильна в области рН 2,5-б,0 и успешно применяется для препаративного гидролиза высокомолекулярных белков, присутствующих в некоторйх кислых пищевых напитках и отрицательно сказывающихся на их качестве.
КП из пектофоетидина П10Х имеет молекулярную массу около 40000, инги-З0 бируется N-2,4-динитрофвнил-N-диазоацетилэтилендиамином и пепстатином, а ее активность при 20 С (рН 2,5-б,0) сохраняется лишь в течение 24 ч, после чего укаэанная KII полностью инак" 35 тивируется .
Использование КП для гидролиэа высокомолекулярных белков в силу указанных свойств связано с рядом трудностей, обусловленных низкой стабиль-40 ностью препаратов, приводящей к существенной потере активности КП при проведении гидролиза белков в течение 2-3 ч. Эти трудности могут быть преодолены использованием препаратов 45 иммобилизованного фермента.
Известен способ получения иммобилизованной кислой протеинаэы путем ковалентного связывания фермента с водонерастворимым носителем, заключаюцийся в том, что модифицированное аминопропилтриэтоксисиланом неоргаическое стекло, выступаюцее в роли водонерастворимого носителя, обрабатывают глутаровым алвдвгидом, а затем раствором фермента (1).
Недостатком способа являются низкая ферментативная активность препаратов иммобилизованного фермента (она составляет 23-243 от исходной), 60 а также низкая устойчивость препаратов при хранении за счет гидролиза аэометиновых связей, посредством.которых проводится ковалентное связывание фермента с носителем. 65
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилизованной кислой про-.виназы путем связывания фермента с водонерастворимым носителем, который за-! ключается в обработке нерастворимого
L стекла $ -аминопропилтризтоксисиланом (введение на поверхность стекла первичных реакционноспособных аминогрупп) в ацетоне, последующей обработке модифицированного носителя янтарным ангидридом в диметилформамиде (введение карбоксильных групп) и последующем активировании карбоксильных групп носителя водорастворимыми карбодиимидами и обработке активированного носителя раствором фермента при 4 С в течение 12 ч (2).
Недостатком способа является низкая ферментативная активность иммобилизованного фермента,. составляющая
23-51% от исходной.
Цель изобретения - повышение ферментативной активности °
Поставленная цель достигается тем, что в способе Получения иммобилизованной кислой протеиназы, заключаюцемся в связывании фермента с носителем, ферментосодержащий раствор предварительно подвергают ацилированию хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при рН 2,5-,5 и мольном соотношении фермент: хлорангидрид — 1г(100-400) и связывание
Фермента с носителем осуществляют совместной полимеризацией ацилированного фермента с гидрофильным ненасыщенным мономером в присутствии биФункционального сшивателя.
Обычно в качестве ферментсодержащего раствора используют раствор пектофоетидина П10Х или его ультраконцентрат.
В качестве гидрофильного мономера обычно используют акриламид или иетакриламид или N-винилпироллидон, в качестве сшивающего агента N,N-метиленбисакриламид -или диэфир метакриловой кислоты и этиленгликоля со степенью полимеризации 3 или 13, При этом полимеризацию обычно про- водят при концентрации гидрофильного мономера в реакционной смеси 2,520 вес. Ъ, а бифункционального.сшивающего агента 0,1-1(вес.Ъ, Способ позволяет получать иммобилизованный ферментный препарат на основе кислой протеиназы с активностью 93-99Ъ.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Соответствующее количество пектофоетидина П10Х, имеюцего определенную активность, которая выражается в единицах активности, растворяют в
100 вес.ч. воды, добавляют необходимое количество хлорангидрида, пере1014882
45 Пример 8, Все операции выполняют так же, используя вместо раство50 мешивают в течение 15-20 мин. затем в эту же смесь вносят гидрофильный мономер, бифункциональный мономерсшиватель, инициатор радикальной полимеризации (персульфат аммония) и продувают аргоном в течение 2030 мин. После этого добавляют каталиI затор полимеризации (N, N, N, N-тетраметилэтилендиамин) и полимеризуют 1 ч. После окончания полимеризации получившийся гель измельчают на.нейлоновых ситах, промывают водой и водноспиртовой смесью и оставляют набухать в буфере, в котором предполагается проведение определения Ферментативной активности. Общее время получения геля 4-5 ч.
Образующиеся продукты представляют собой сильно набухающие в воде гидрогели и используются для гидролиза белков либо путем инкубирования соответствующей навески геля с раствором белка, либо путем хроматографирования раствора белка через колонку, заполненную нерастворимым полимером с иммобилизованной КП.
Поскольку исходное вещество представляет собой неочищенный продукт, то количество КП в нем крайне трудно установить. Препараты подобного типа характеризуют относительной активностью, выражаемой в единицах протеолитической активности, При этом за единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента в мг, которое вызывает прирост оптической плотности при 280 Нм на одну единицу (при определении активности соответствующим образом) за 1 мин. Поскольку истинное количество КП в пектофоетидине П10Х неизвестно, то активность ее определяется по единицам активности. Так 1 г пектофоетидина
П10Х имеет активность 40 единиц. Протеолитическая активность при этом определяется по 2Ъ-ому раствору. гемоглобина в 0,05 M ацетатном буфере (pH 4,5) при 37 С. Степень связывания фермента определяют по отношению активности получаемого препарата, промытого.до полного вымывания несвязанного белка, к активности исходного, выраженную в В.
Ацилирование хлорангидридами пектофоетидина П10Х в растворе, также как ацилирование его ультраконцентра5
40 та, проводят при рН 2,5-4,5 ° Более высокие значения рН приводят к инактивации фермента. В качестве гидрофильных мономеров используются широкораспространеннае мономеры — акриламид, метакриламид, винилпироллидон и пр. Сшивателями являются типичные бифункциональные мономеры: акрилаты и метакрилаты этиленгликоля или. его тепломеров и полимеров (эфиры ТГМ-З, ТГМ-13 и пр.), N,N-метиленбисакриламид и пр.
Инициаторами радикальной полимеризации служат пераульфаты щелочных металлов с тетраметилэтилендиамином, рибофлавин, которые растворимы в воде и работают при комнатной температуре. Инициатором может служить
Уф-облучение.
Пример 1. 20 r пектофоетидина П10Х растворяют в 100 мл воды охо
I лаждают до 0 С и доводят до рН 2,5.
К этому раствору по каплям добавляют
? г хлорангидрида акриловой кислоты и раствор перемешивают в течение 1520 мин, доводят до комнатной температуры за этот промежуток времени, и в этот же раствор добавляют при перемешивании 5 r акриламида и 0,2 r метиленбисакриламида. В раствор вносят 0,003 r персульфата аммония, продувают аргоном в течение 20-30 мин, добавляют 0,003 r тетраметилэтилендиамина и оставляют на 1 ч. Образовавшийся гель измельчают на нейлоновых ситах, промывают водой и 5Ъ-ным водным этанолом из расчета 0,5 л раствора на 1 г геля. Протеолитическую активность определяют по 2Ъ-ому раствору гемоглобина в качестве субстрата. Гемоглобин растворен в 0 05 М ацетатном буфере (рН 4,5) при 37 С.
Активность через неделю и через месяц определяют аналогичным образом, храня препараты при 4ОC. ра.пектофоетидина (10 г на 100 мл Воды) ультраконцентрат пектофоетидинаП10Х в количестве 100 мл. Содержание активного начала в препарате также равно активности 10 г пектофоетидина П10Х.
Данные по примерам 1-7 приведены
s табл., 1014882
° E и о °
I!I m
3 a
4->
Ф о
<ч о а а
Щ Ю CO !!Ъ Ъ М
1 I
Х Х
Гл н
v o ж ж
Г0 И3 (Ч Ю
СЧ
o u
2С Х
Ф l0 о сч л с
Ю о о сЧ л в 1 ч о
Ch l
1 I
Ф4, I ed о о Ф РФ
Ю л 1
Ж 1
Х 1
65 о о (Ч л о сч л.СЧ Ю (Ч
Ю о о
<Ч
Э edAzedauNeg о а в
Ь (Ч Че
М Ф о о
Ь Ф Г ) о о
<Ъ Е4 о о о о л л
Ю
Ю л о о о о
<. л о о о о
Ю
Ю
00 о ю о о 3 CO о о о о
Ю З ю о о о
ОЭ 10
+CO и
Ф °
М
g х в
Е
Aj о, Х о о о л сЧ а о л
<Ч
D O
cv л
deNHdl1
ЦОНЧГГЭЬЕН ХО икоэи Г еэбаь чхоoнaихму
ЦОНЧГГатЛН
ХО ф ОПГЭЙЭН T 6ЭЙЭЪ ЧХООННИХХ цонйохои z.о ихоонкихмз !!
ЙХООНКИХМЭ ГГИНИйэ дц иГГэл чхooнaихмe ненбеииА:) Л 911 ЭХЭ ЯИЯО О ЕХ ОЭЪИГГОЯ
О Г -aNoHoN odoHalcH@odhèà oaõoýüèþo о !!
Ж
Х л ЭГГиб?ГилнебоГГх окхоэьиГГоу
1
edoazoed gd
1
I
l
1 1rN !чйоa оaz,оэьиГГох
I
1
I ихоонаихмe .-йинийэ, :И! чхоонаихме неяоэьихииоэхобд
1
1.Г ЕНИГГИХЭОфОХЯЭН ОаХОЭЬИГГОХ
Кх
1 ес g ви
1 ХЕВ а !!! 1: о
l г ) 0
1 О
Or, 1
1 !!! Г.ф о
I Ц с
1 АГ!Я
Х Гл и а в ц с
I Я сп
1 12, I I xМ
-хм яво4 ! 1: в ока
1: х иeц жио
1 Х И
1 1
1 Ф Ы оо л
I!Ir Х оюв
Ц их в
OO I хcto
I sIg ц о рц и
Р и о
1 4 Ц
x r. x мхц ам Г о ах ц !с в х
1 Х
1 1
1 !!!
1 Х М,1014882
Составитель О. Скородумова
Редантор Е.Лушникова ТехрЕд C.éèãóíîâà
Корректор A.Äçÿòêî
Заказ 3132/21 Тираж 523
BHHHGH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Подписное
Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать высокоактивные препараты иммобилизованной кислой протеиназы. Получающиеся иммобилиэованные препараты стабильны в течение длительного времени (стабильность самой КП всего 24 ч), не требу ет специальной очистки фермента, поскольку предлагаемый способ иммобили-, зацни позволяет одновременно иммоби-. лизовать КП из сырца и сформировать матрицу водонерастворимого носителя, для чего не требуется очищать фермент по известным биохимическим способам.
Способ можно использовать для очистки различных кислых пищевых растворов от высокомолекулярных белков.