Смешанные ангидриды 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1- оксилпирролин-3-карбоновой кислоты в качестве спиновых меток для биоорганических соединений белково-пептидной природы

Смешанные ангидриды 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1- оксилпирролин-3-карбоновой кислоты в качестве спиновых меток для биоорганических соединений белково-пептидной природы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Смешанные ангидриды 4 бром-2 ,2,5,5-тетраметил-1-Ьксилпирролин 3-карбоновой кислоты общей соосоон Sf HjC- у СН5 где R - иаобутил, этил, в качестве спиновых меток для бйоорганических соединений белково (Л пептндиой природы. .

ССЮЭ СОЕатСНИХ

С NWNllltE

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H a s TOeCVWV ceNllrraaersv зе (.o()econ .mc сн, . 3 4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ОСОР

IN" ИВИНОЙ Ю (21) 3386651/23-04 (22) 29.01.82 (46) 07.05.83. Бвл. 9 17 (72) В.Д.Колле, А.В.Чудинов, Э.Г.Розанцев, М.П.Филатова, Н.А. Крит, и Н.В.Бесчастная (71)Ордена Ленина институт хими ческой физики AH СССР и Институт биологической и медицинской химии

АИН СССР (53) 547.743.1(088.ф) (56) 1. Метод спиновых меток.

Под ред. Л.Берлинера И., Мир!, 1979, .с.220.

2. Авторское свидетельство СССРпо заявке В 3299063/23-04, кл. С 07 0 207/24, 22.12.81. (54) СИЕШАИНЫВ АНГИДРИДЫ 4-БРОМ-2р2;

5 5-ТЕТРАИЕТИЛ-1-ОКСИЛПИРРОЛИН-3-КАР -

3Щ ес 07 О 207/ 22) С 07 0 207/46. ВОНОВОЙ КИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ СПИНОВЫХ

НДФОК ДЛЯ БИООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕ. НИИ БЕЛКОВО-ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ. (57) Смешанные ангидриды 4-бром-2, 2, 5, 5-тетраметил-1- ок силпирролин 3-карбоновой кислоты общей .формулы где Н - изобутил, зтил, в качестве спиновых меток для био- Я органических соединений белковопептидной природы.

1016281

Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к смешанным ангидридам 4-бром, -2,2,5,5-тетраметил-l-оксилпирролин-

-3-карбоновой кислоты общей формулы

65 где R - изобутил, этил, в качестве ацилирующих спиновых меток для биоорганических соединений белково-пептидной природы.

Укаэанные свойства позволяют пред-. полагать воэможность применения этих соединений в молекулярной биологии.

Известны смешанные- ангидриды 20

: угольной и 2,2,5,5-тетраметил-l-оксилпирролин-3-карбоновой кислоты используемые в качестве ацилирующих спиновых меток для биоорганических . соединений белково-пептидной приро- 25 ды 1).

Недостатком этих соединений является их трудная доступность, поскольку основным соединением в их .синтезе является кислота l! полу- 3() чаемая сложным многостадийным синтезом; кроме Tol î, недостатком яв.ляется малая устойчивость-при хра. нении, что затрудняет их использование в качестве спиновых меток.

Так, уже после 10-15 дней хранения смешанных ангидридов кислоты и по! являются продукты их гидролитического разложения.

Известна устойчивая ацилирующая 40 спиновая метка 3-азидокарбонил-6бром-2,2,5,5-тетраметилпирролин-1оксил ф (2 g.

Недостатком указанной спиновой .метки является недостаточная универсальность(поскольку соединение может использоваться как ацилирующая спиновая метка для биоорганических соединений белково-пептидной приро.ды, содержащих свободные аминогруппы, но не взаимодействует со свободными гидроксигруппами. Kpc%e того, соединение ф способно перегруппировываться в соответствующий изоцианат, который взаимодействует с биоорганическими соединениями по механизму карбамоилирования.

Целью изобретения является получение стабильной универсальной ацилирующей спийовой метки для биоорганических соединений белково-пеп- 6О тидной природы.

Поставленная цель достигается смешанными ангидридами 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-l-оксилпирролин-3-карбоновой кислоты общей формулй 1.в качестве ацилирующих спиновых меток для биоорганических сое-: динений белково-пептидной природы.

Указанные соединения получают взаимодействием 4-бром-3-карбокси-2,2, 5,5-тетраметилпирролин-l-оксила с соответствующим хлорформиатом при охлаждении в среде сухого бенэола.

Выход соединений - 98%.

Соединения общей формулы7представляют собой желтые кристаллы, хранящиеся на воздухе без следов разложения в течение шести месяцев.

Пример 1. Иэобутилоксикарбснил 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-lоксилпирролин-3-карбоксилат.

1,32 г (5 .мйоль) 4-бром-3-карбокси-2,2,5,5-тетраметилпирролин-lоксила растворяют в 15 мл сухого бенэола, добавляют 0,77 мл (5,5 мМоль) сухого триэтиламина и к образовавшейся смеси прикапывают при охлаждении и при перемешивании во льду раствор 0,75 г (5,5 мМоль) иэобутилхлорформиата в 10 мл сухого бензола.

Перемешивание продолжают 4 ч при

20ОС, выпавший осадок отфильтровывают, промывают бенэолом, фильтрат и смывные воды упаривают в вакууме и получают 1,79 r (98%) соединения общей Формулы Х(где R - - ..изобутип, т.пл. 130оС .(раэл.).

Найдено, %: С 46,77; Н 5(99

Н 4(15.

С12Н(ЧВАННОЮ

Вычислено(Ъ: С 46(29 Н 5,83;

И 3,861 мол.масса 363,23, Масс.-спектр 362 (М)+(364 (М) ЭПР (СНСВд ) а =l, 5 мТ,g=2, 0046, ИК (KBr) .1605 (С=С), 1735,- 1800 (СО) .

Пример 2. Этилоксикарбонил

4-бром-2,2,5,5-тетраметил-l-оксилаирролин-3-карбоксилат (соединение общей формулы Е (где R - -этил).

Получают аналогично из 1,32 г (5 мМоль) соединения lit и 0,6 г (5,5 мМоль) этилхлорформиата. Выход 1,,6 v (98%). T.пл. ) 130 С.

Найдено,. Ъ: N 4,27.

С Н . Вх Б05

Вычислено, В: 0 4,18.

Мол. масса 335,18. Масс-спектр

334 (М+), 336 (М+), ЭПР (СИСЕ ), аМ= 1,5"МТ(g 2.„0646(ИК (KBr)

1605 (C=C), 1730, 1800 (СО). укаэанные смешанные ангидриды общей формулы I. Meãóò быть использованы как ацилирующие спиновые метки для биооргаиических соединений белково-пептидной природы, что подтверждается их взаимодействием с глутамил-изолейцил-пролил-пролином, содержащим свободные аминогруппы, и тнрозил-фенилаланином, содержащим свободные гидроксигруппы.

36,5 мг соединения общей формулы где R — изобутил, растворяют в

1016281

Составитель И. Борин

Редактор О.Половка Техреду.Кастелевич Корректор < Рошко

Заказ 3312/23 Тираж 418 Подписное.

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

««««

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

0,1 мл тетрагидрофурана и затем,до- . бавляют раствор хлоргидрата бензило .

:вого эфира глутамилизолейцил-пролил-пролива в 0,1 мл тетрагидрофурана и 0,028 мл триэтиламина. Инкубацию пептида с меткой проводят в течение суток при комнатной температуре. Полноту ацилирования контролируют бумажньэ электрофорезом (900 B) в l Я уксусной кислоте (рН 2,4) ио исчезновению нингридридно40 го окрашивания исходного тетрапептида. Несвяэавшуюся метку отделяют с помощью тонкослойной хроматографии иа силикагеле 5/40 в системе.этилацетат - хлороформ (1:1). индивиду- 15 альность спин-меченого пептида проверяют:хроматографией на пластинке Силуфола в системах бутанол- уксусная кислота - вода (13:2:5)R<

0,44., хлороформ - метанол (5:1)Й 70

0,46, этилацетатпиридинуксусная кислота - вода (5:5:1:3) R 0,53, уксусная кислота - этилацетат — бутанол - вода (1:2,1:1)В 0,75 (elan -103,0 С (с 0,5 метанол).

Спек9р ЭНР спин-меченного пептида характеризуется временем вращательной корреляции СФ l .10-&ceK-1 .

Аналогичные результаты получены при использовании в качестве спино- . вой:метки соединения общей формулы Х, где R — этил. 40 мг метилового эфира трет-бутилоксикарбонилтироэилфенилаланина растворяют в 0,2 мл тетрагидрофурана и добавляют 70 мг соединения общей формулы I, где R - -этил, и

0,025 мл триэтиламина до рН 10. Ин-.. кубацию пептида с меткой проводят в течение 16 ч при комнатной температуре. Полноту ацилирования контролируют по -исчезновению в УФ-спектре полосы поглощения свободного гидроксила тирозина. После окончания реакции растворитель упаривают, остаток растворяют .в абс. эфире и высаживают .петролейным эфиром. Индивидуальность спин-меченого пептида проверяют хроматографией на пластинке Силуфола и системах хлороформ - метиловый спирт {9,5:0,5).R

0,475, хлороформ - этилацетат (1:Х}

R< 0,82. Спектр ЭПР спин-меченого пептнда характеризуется временем вращательной коррекцин ь 3.-1.0- 0.

Таким образом, соединения общей формулы I являются ацилируккцими спиновыми метками для биоорганических соединений белково-пейтидной природы. По устойчивости соединения общей формулы I превосходят смешанные ангидриды 2,.2,5,5-тетраметил-lоксилпирролинкарбоновой кислоты fl y кроме того, соединения общей формулы являются более универсальными, чем известная ацилирукщая спиновая метка З-азодокарбонил-4-бром-2,2, 5,5тетраметилпнрролин-1-оксил N,так как взаимодействуют как с аиино", так и с оксигруппами биоорганических соединений белково.-пептидной природы.