Способ получения эритроцитарного диагностикума

Способ получения эритроцитарного диагностикума

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОССЖ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТ РОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА «|пя выявленва антител путем вз мутанта 5ci€tnonet ci tninnisoto R 595 твколнпица с irocne,Ryioatefi сор&гаей его на эрятрооитах, о т л в ч а ю ш н ftСи тем, что, 6 целью повьппеняя спешн .фической чувстввтепьноств шагяоствку. ыа, натввный глвкопнпвд сорбяруют на эрвтроиитах в првоутствнв бычьего сывороточного альбумвна. 5

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СЭ,НЦ»

РЕСПУБЛИК. уи) А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

К АВТОРСКОМУ СИЩ ЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И QTHPbfTHA (21) 3332973/13 (22) 04.08.8:1 . (46) 15.05,83. Бюл. М 18 . (72) Т. А, Котова, 8. Г. Лнхоцец

А. М. Поверенный, A. С» Саенко н А. Л. Табачник (71) Московский научно-исспецоватепьо кий институт. Вакцин н сывороток нм. И. И. Мечникева н Научно-нсслецо ватецьский ннстигут медицинской радио» .логии АИН СССР (53} 576.8.097.3 (088.8) (56) 1. Johnes Й.А., Sruins 5.С.,-. Ие

СаЬе Ч;й. Immunlzati on with R-mutanйз -оf Заlmonelia minnesota. Sегоlogical Response to Lipid A and the

LPS of Re-Hutants inf and Immun..

1977 17 1 °,.SU„„,1017339 А (54) (57) СПОСОБ НОЛУЧЕНИЯ ЭРИТ

POUHTAPHCfO ДИАГНОСТИКУМА @ng

° выявлении:антител путем выцеленищ. на мутанта 5сФпоьеИц minnisatQ R 595 гпиколнпица с после,цукнцей сорбпней его на э1жтроцитах, о т л н ч а ю m н й. с я тем, что, с целью повышения специ.фической чувствительности диагностику ма, натнвный глнколнпнц сорбируют н эритропитах в присутствии бычьего сывороточного альбумина.

1017339

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения эритроцитарного диагностикума цля выявления белков, способных нейтрализовать биологическую активность энцотоксинов различных грамотрицатепьных бактерий.

Известен способ получения эритрс цитарного диагностикума для выявления антител путем выделения из мутанта ЗаВттюпРИЮ rn anisOta Я,595 гликолипица с последующей сорбц ней е го на эритроцитах, причем сорбировать гликолипиц можно только после обработки его щелочью! Ю

Оцнако известный способ нецостаточ но чувствителен, поскольку гицролиз щелочью привоцит к потере антигенных цетерминант, что снижает чувствитель ность диагностикума, Белью изобретения является повышение специфической чувствительности эритроцитарного циагностикума.

Укаэанная цель цостигается тем, что согласно способу получения эритроцитарного циагностикума для выявления антител путем выцепения из мутанта

5с10то116Исн taitlrnSota R 595 глико- . липида с последующей сорбцией его на эритроцитах, нативный гликолиннд сорбируют на эритроцитах в присутствии бычьего сывороточного альбумина.

Способ осуществляется следующим образом.

Свежие человеческие эритроциты группы О/1Рн+ отмывают 0,9%-ным раствором .хлористого натрия от плазмъ (центрифугируют 15 мин при 2500 q, супернатант отбрасывают, эритроциты вновь суспенцируют в физиологическом растворе, процедуру повторяют трижцы). Отмь|тые эритроциты суспендируют в станцаръном солевом растворе (4 5 г цитрата натрия + 8,8 г хлористого натрия, дистиль лированной воцы цо 1 л) цо конечной концентрации 5-6% и циализуют против формалина, объем которого составляет

1/5 часть от объема суспендированных эритроцитов, 5-6 сут при 4-6о, периощ чески помешивая. После диализа эритроциты отмывают от избытка формалина стандартным солевым раствором, готовят

50фную суспензию в этом же растворе, добавляют формалин цо концентрации

1% и .хранят в таком вице при 4-6 .

6 мл 50%-ной суспензни эритроци» тов отмывают трижды от формалина стандартным солевым раствором.

5 мг танина растворяют в 200 мл с0, 15 Я натрий-фосфатного буфера (100 мл

0,15 М раствора хлористого натрия

+ 100 мл 0,15 М натрий-фосфатного буфера рН=7,2) суспендируют в этом растворе формалинизированные эритроциты, инкубируют 10 мин при 37 и. цетрифугируют 15 мин при 2500 .

Супернатант отбрасывают, эритроциты суспендируют в том же буфере, вновь центрифугируют.

К полученной после центрифугирования суспензии эритроцитов добавляют

0,15 М натрий-фосфатный буфер рН=6,4, соцержащий комплекс гликолнпида с, бычьим сывороточным альбумином в

15 концентрации 200 мкг. гликолипица в 1 мл. Для получения комплекса 10 мг

l гликолипица, полученного хлороформметанольной экстракцией (2), растворяют в 10 мл деионизированной воды, о добавляя триэтиламин до концентрации

l,5%, затем цобавляют 0,5 мл раствора, содержащего бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мл/мг, перемешивают и затем отгоняют триэтиламин на роторном испарителе. После отгонки триэтиламина комплекс глико,пипида с бычьим сывороточным альбумином разводят фосфатным буфером (0,19 М, рН=6,4) так, что концентра30 ния гликопипида составляет 200 мкг/мл.

Далее смесь эритроцитов и комплек са гликолипида с альбумином инкубируют 30 мин при 37, отмывают триж35 цы станцфртным сОПОВым -pacraopoM, соцержащем 0,03% бычьего сывороточного альбумина, готовят 10%-ную суопензию эритроцитов в этом же растворе, добавляют формалин цо конечной конценчь4р рации 0,1% и .хранят при 4О.

Для постановки реакции пассивной гемагглютинации готовят 1%-ную ego-», пензию эритроцитов в стандартном солевом растворе, содержащем 0,03% аль

45 бумина. В каждую лунку вносят по 50 мкд соответствующего разведения сыворотки, приготовленного на мединалвероналовоМ буфере рН=8,6 и по 25 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов.

В опытах пассивной гемагглютинации (РПГА) кроличьи сыворотки против гликолипида и липица А реагировали с полученным эритроцитарным пнагносимкумом в разведении 1:1024 и 1:256 соответственно, тогда как эритроциты, сенсибилизированные только бычьим сывороточным альбумином, агглютилировались теми же сыворотками в разцелении 1:16 и 1:8 соответственно.

3 1017339 ф 1

Реакция пассивной гемагглютинации, гликолнпидом илн липидом А в KoHUeHT ,эритроцитов, сенснбилизнрованных глн рации 1 мкг/мл. копнпидом ъ комплексе.с быпим сыво- При сравнительном изучении предроточным альбумином при добавлении . ложенного диагностнкума с прототипом кроличьих сывороток против гликолипи- g (эритротаты, сенсибилизированнйе глида специфически ингибировались глико колипндом или лнпидом А после обработ липидом ипи лнпидом А в концентра- ки последних щелочью); в РПГА с ис ции 0,2 мкг/мл и 1 мкг/мл соответст- ° попьзованием гипериммунных кроличьих венно. При испопьзовании сывороток сывороток к гликолипиду Ре и липиду А полупротив лнпида А реакция ингибировалась уу ченырезультаты,представленныэтабл.1.

r о

ТаблицаХ

Нативный .гликолипнд Re в комплексе с БСА .

1: 1024

1 . 256

Гликолипид Ре, обработанный щелочью (прототип)

1: 128

1; 64

Липнд А в комплексе с БСА

1: 256

Лнпнд А, обработанный ,щелочью

1 +32

Из табл. 1видно,,что эритроциты, сенсибилиэированные нативиым. гликопи- : пидом Re или аипкдом А в комплексе с БСА обладают бопьшей чувствительнос43 тью в РПГА с антисыворотками против гликолкпида Яе или липида А, чем эритроцйты,исцопьзовавшиеся в качестве прототипа.

Предложенный диагностикум позволяет выявить антитела к гликолициду Ре == хемотипа и липиду А в тех случаях, где они не обнаруживаются в РПГА "",. эритроцитами, сенсибилизированными гликоципидом или лицидом А после их обработки щелочью (табл. 2). 1017339

Таблица2 Йптериммунная к гликолнпиду Ре

1: 128

1: 1024

Нормальная с-ка кроликов

1:2

Больные с инфарктом миокарда

1: 128

1:2048. Больные с системной красной волчанкой

1: 1024

1:2

1:256

1:2

С-ка крыс после ожога щи ПИ Заказ 3423/9 Тйраж 713 Подписное

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Специфичность предложенного циаг. ностнкума определяли по реакции ннгнбнровання РПГА с гнпернммунной сыво роткой против гликолнпица йе. Были изучены лнпопописахарнцыр Я -форм различных внцов Ру-бактерий, лнпиц А, полученный гнцропнзом этих ЛПС, глн колнпнц Re -.хемотнпа, БСА, метнлнро ванный БСА, человеческий сывороточный альбумнн, дезоксирибонуклеиновая кислота, цекстран сульфат. ИЫгибирую-. щей активностью облацалн только глнколи1пш ЦФ и липнц А.

Прнмененне полученного эрнтроцнтарного днагностикума позволило установить, что в сыворотках зцоровых люцей (цоноров) антитела, вызывающие гемназглютннацню, соцержатся в рецнпрокном титре 2113,7, Прн брюшном тифе легкой н срщней тяжести течения антитела выявлены в титре 240,3+32,8, а прн тяжелом течении - в тичре 49,8ф12,8.

У хронических носителей брюшнотифоэных бактерий антитела выявлены в тит ре 118+24,6.

35 Обработка кролнпих сывороток и сывороток от больных люцей 2меркап тоэтанолом прнвосцтла к резкому сянж нню нх способности вызвать гемагглютннацню эритропнтов, сенснбв изнрован40 ных нативным глнколющцом. Эти ре зультаты показывают, что агглютннацию эритроцнтов, сенсибнлнзнрованных натнвным глнколипнцом, . вызывают нммуноглобулнны класса N илн другие

45 белки, имеющие 3-З связи.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить спецнфнческую чув ствнтепьность днагностикума в 2-3 ра

So за, а кроме того позволяет выявлять антитела как к щпцщу А, так и к глнколнпнду, исключая необхоцимость ио пользования двух циагностнкумов.