Способ получения личинок геогельминтов
Иллюстрации
Показать всеРеферат
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЧИНОК ГКО-ГЕЛЬМИНТОВ, включающий выделение из самок нематод яиц, культивирование яиц на питательной ереде и 6тделение вышедших личинок, о т л ич a ю itt и-й с я тем, что, с целью повышения выхода личино к, перед выделением яиц самок Нематод помещают в 3-5%-ный раствор; fi -диэиламиноизобутирони .трила на 2-4 ч.
СОЮЭ иОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
И5П А 01 К 67 00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМЪ СВИДЯТЕЛЬСТВЪ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ. ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3387010/30-15 (22) 10.12.81 (4.6) 30.05.83.. Бюп. В 20 (72.) И. A. Садыхов р Р. И. Ахмедов и E. М. Ханбекова (71) Институт зоологии АН Азербайджан« ской ССР . (53) 576.8 ° 093.1(088.8) (56).1. Кротов A. И. Содержание и культивирование паразитических нема-. тод в искусственных условиях. "Успехи современной биологии", 1958,- 46, М 2, с. 230 -239.
: 2. Петров A. М., Гагарин 3. Г.
Методы культивирования яиц и личинок гельминтов. Лабораторные методы исследования в ветеринарии, 1953, т.1, с. 341-351.
„.SU„„4 А (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЧИНОК
ГЕО-ГЕЛЬИИНТОВ, включаюедй выделение из самок нематод яиц, культивирование яиц на питательной среде и отделение выцедших личинок, о т л ич а ю щ и.й с я тем, что, с целью повышения выхода личинок, перед выделением яиц самок нематод помещают в 3-5%ньтй раствор 9 --дизтиламиноизобутиронитрила на 2-4 ч.
1020104
Изобретение относится к ветеринарной,гельминтологии, в частности к культивированию личинок нематод в лабораторных условиях при изучении экологии экзогенных стадий развития нематод, влияпия физических факторов среды и разработки новых методов профилактики нематодов сельскохозяйственных животных.
Известен способ получения личинок гео-гельминтов в лаборатории, кото- 10 рый осуществляется следующим образом яйца, полученные из фекалий методами, .флотации или осаждения, или яйца, полученные из гонад самок путем потрошения,. помещают в оптимальные для развития . 15 условия, используя в качестве среды воду, воду с фекалиями, .опилки и др.
Через определенное время (в зависимости от условий культивирования) выходят личинки, которых надо различ- 0 ными способами собрать, очистить от частиц среды и микрофлоры антибиотиками, перед посевом на новую чистую среду для дальнейшего культивирования провести подсчет, отобрать необходимое кх количество )1).
Недостатками способа являются трудоемкость и низкий выход личинок.
Известен также способ получения личинок гео-гельминтов, включающий выделение из самок нематод яиц, куль- З0 тивирование яиц на питательной среде и отделение вышедших личинок $ 2) .
Недостатком данного способа является малый выход личинок, так как при промывании их антибиотиками и 35 водой и переносе в другую среду часть . личинок теряется в период культивирования, Цель изобретения — повыаение выхода личинок гео-гельминтов.
Поставленная цель достигается тем, что перед выделением яиц самок нематод помещают в 3-59-ный раствор
-диэтиламиноизобутиронитрила на
2-4 ч. р -Диэтиламиноизобутиронитрил оказывает стимулирующее действие
ыа яйца в гонадах живых самок. Через
1-1,5 сут после гибели самок в воде при 19-23 С в тело ее выходят активные личинки. Они питаются внутренними органами, продвигаясь к вульварному или ротовому отверстиям, через которые могут выходить во внешнюю 55 среду. Кроме того, при переносе самок из раствора в воду на них оста.ются частицы р -диэтиламиноиэобутиронитрила, который ингибирует развитие микрофлоры в среде культивирова- 60 ния. ," -Диэтиламиноизобутиронитрил относится к химическому соединению, в частности к Р --М-(диалкил) эамещен- 5 ным йасыщенным алифатическим аминонитрилам изостроения, и имеет формулу
6Н> Нр
N-1н;dH — бБ
OH q— d?4 6<
Г
Структура р -диэтиламиноизобутиронитрила подтверждается результатами
ИК-спектроскопического анализа.
В спектре соединения отмечаются полосы (см ) диэтиламинной.группы:
Ен3 бн2
/ бНз — Н g
780, 949, 1010, 1080, 1140, 2825, 2880, 2940, 2980, 3200, 3450 и изобутиронитрильной группы: бн2 бн eN бн
830, 940, 1280, 1380, 2250, 2825, 2880, 2940, 2980. Подчеркнутые полосы имеют нахождение полос второго фрагмента.
Все эти полосы, имеющиеся вприлагаемом ИК-спектре, подтверждают структуру р диэтиламиноизобутиронитрила, который образуется в результате присоединения диаэтиламина к метакрилонитрилу (см. чертеж).
Съемка проб производится на ИКспектрофотометре ИК-20 ("К Цейсс"
Иена). Прозрачный жидкий образец снимается без растворителя в герметичных стандартных кюветах из KB r c толщиной 40-54 мкм.
Испытание соединения s качестве стимулятора развития яиц и выхода личинок геогельминтов и ингибитора мйкрофлоры в лабораторных условиях проводят в чашках Петри на гельмин-. тах из родов Тг)сЬеЫгощЯцз, йвea%ttodirus И1агзЬоИод.4а и видов Носп оисМь contp Kus и ОМеи од а
Ыг сои сюс Ьо
Гельминтологический материал собирают иэ кишечного тракта овец и хранят до начала опытов (3-4 ч) при
28-32 С в термосе с физраствором.
Растворы р -диэтиламиноизобутиронитрила готовят в дистиллированной воде в объемных процентах.
Всего поставлено 15 опытов в трех повторностях, пяти вариантах. В каждую чашу Петри вносят по 10-20 самок одного из названных видов нематод, в гонадах которых имеются зрелые яйца. По окончании экспозиции 70% самок, не отвытых от раствора, переносят g водопроводную дехлорированную Воду. Контролем служат самки тех же видов, не обработанные раст1020104 вором р -диэтиламин зи зобутнронитрила., . содержащиеся в тех же условиях.
Температурные условия опытов19"23 С.
Наблюдения за поведением и развитием объектов. проводят с помощью бинокулярной лупы ЩБС-1 и микроско па ИВР-1. дважды в сутки.
В период массового выхода личинок в. теле самок обнаружено 16-25, живых активных личинок. . 10
П р н м. е р 1. Стимулирование развития яиц и личинок в самках
Hacmonctes саббат Ыэ.. Живых самок гемойхов помещают- в чащки Петри с водным раствором р -дизтнлаыиноизобуткро45 нитрила 3 и 54-ной концентраций на1, 4 и 21 ч. По окончании экспозиции самок, .еще живых, переносят (не отмывая) в 60. мя водопроводной воды (703 самок). Через 24:ч самки гибнут, щ а.через 48 ч после начала опыта иэ яиц внутри тела самки начинают Вв -ходить личинки. I стадии,. активно двн гаясь в передний отдел тела. Наиболее массовый выход их иабякЩаЕтоя Ри.. экспозиции в растворе 4 ч и 5%-иой концентрации раствора в дехлорирован-: ной воде при 19-23 С. Начало выхода личинок - конец первых суток после гирелн самки.
Стимулирование развития яиц прн помощи Р -днзтнламиноиэобутиронитрила происходит только в гонадах живых самок (табл. 1, пункт 1).
П р и и е р 2. действие раствора
-дизтиламнноизобутироннтрила на . самок н яйца в них:из рода ÑÌ8
Ьоп(рРмэ . Иэ табл. 1 (пункт 2) видно, что стимулирующее,действие раствор. оказывает также на аивых самок нематод.
Живых самок трихостронгилнд помещают в 2 и 5%-ные раствсры биологически активного вещества на б сут,. 3 и
4 ч, затем, не отънаая, s водопроводную декорированную воду (табл . 1.)..
Наблюдения показали,.что длительная экспозиция савюк в растворе препятствует дальнейшему развитию яиц - они гибнут. Наиболее эффективны условия экспозиция самок в растворе 4 ч при концентрации в объеме 5% и 19-23 С.:
Через 1-1,5 сут после гибели самки в полость ее тела. выходят личинки.
zozo>o<
+ 1 н
) +
П I> 11
П Il П Я
+ о
+ н п ьь
I I о
Х I
Ж I
CO
I w
Ц 1 ц(—
О о о Х
t 1
П П И
O l
)Х! П
1 Я t ! gl,1 Ф
1 I с«ь
1 Х I
П Еь И о Х
1 +
). I
Х! о! о
I Ж
1 &
I O о пь о пе o
В Э
Э Ц о
1 Р
1 «Ф
I е ———
Н И
П о! 1 1
1 1 1
ХЕХ)
ФХФ) ь)1
ЕьЬ Еi 1 Е:АР l
m! t йО.е
ПЬО). Ха
Е.Ь а, В,t ЬЬЬ а - l
4 g Ф ьье хрясь
1 о 25ьп
«и ь..
Ф 4L 6) . "1
e & I р,o
6 о
5 х х х
° ° ° о о о с«ь C«3 c«t х х ьл ch о х х
° ° е-ь ю о о х ) 1 «
СО о
4 ь ььь !
1 I
1 I
I !
t« I
l f
1 !
1 t! ) е х
1 > I +
Е Х
I Рэ +
I I
Х Е 1
Х I
g4 ььь 1 ььь t X
Х 1 М 1 1 +
РХ ьП 1 Э )о I +
Ь ° ОЯ) Х)м аХХ) ь)1, охх t аь П«Ф 1 ьП 1
Хо)
og i х t х ьь) Х 1 Х t 5 t + цхl e I
ОЦ) Xь«"ь 1
Ф!Я I )
vol 8
П
1 - -к х и к
Фх1 А5 м
1 !
I
1
О о
1 CV
I
1 ш ю I м th ю, щ EA tA Ръ (ч
1 с-!
Д..t, I
I ь о
1 ! о . I
I 3» в 1
3 U 1
1 »А
l.
1
1 .I»
I . 3! Q.
3 .. I <"Ъ
1 ! х .! R.l 3I 1 Ь
Ф 1 1
I Х1а
3 К I 3
t I ! Ц .!. о !,х!
l3I 3
1 3!3 I, 1 .1 э
1 Х t m
1 1
I М 1; 1
О1
1 $1 Р" I
I О3ч I
I "I3 М н 0 о
1 X.1 М ! !33 I и . !.3 х
C InI
» !,!
З 1
3
t
I
1
1 3»
I и
l А!3 I
I Щ
1 »
1 3 б-.— —
R I ок
Х и ! 3!б йУ ! !
\ !
I Ф 1
1 a,Í 1 !
ОЙ t
Ж. C
1 Эя
Ф К.аб
ОХ О 1
ХDIQ !
Ф !.!
I 3 о
1 .д 1
1 g
I Ф 1
I 33
I а
1020104 р + + х
В4 .Х +
+ о х о
3 < Ъ W 6Ъ I
1 ! °
I Ф
I и
l и
t Ф.
I 33
3 Ф
1 . 3
3 М
I ! я
1 3:»
3
I!!б
Ре
Ю
lg
3»
34 о
Х 1 !
33 о х
М ф
C)
СО
«г
00 4 х х
° ° о °
РЪ IA
I е
3 lC
1 О I: б 3 Ф
I и
1
М
3 Ю
3 Х
I 33
I I 3
1К
l ° . 33 а о. ! С» 4
1 1 13Ф
I О К Ф
I 34 Ю 3»
ttl 63
3 Ж Я. 33
Х 33O X- -O
Х I
I О Ф. Ю
М Ф Ф
1х.о а н
1 О И В. и ! 3 . 4!3 33 х х t e я
+ +!o и ям
I Ж в
3 М Ф I» X
I. I» !tI Ф Ф ! о р ц
++1 об!й
+ + I и 33 О
+ + 3. 333 g Ф и ба 3- 2 К
l. !33
I 4Ф Ф К 33
+ +бо х Ф ц.
+ + I L Ж 3» О .
+ + I sO Х Х ,о и
l Ф М 3» Ilt
I 3» К Ф ба 33 О
I Н О Х
+ + I .3» 3. 333
+ + l A Ж и ! м ф о
I Ф I к х
3 3 !33 Ф -Ф
I a g 3 3
I Q 3» 333 33
I. I .I I I
1 1 l 1
3+ Фф ! + с) 5
3 -и «
% «
+
I 3 + Х О
° ° ° ° ! » Е 3 Ъ В
1020104
Прн уменьшении экспозиции до 3 ч время начала выхода личинок увеличивается до 4 сут.
Пример 3. Самок ОэМ)tcqpa
e
Лучшими условиями для выхода личинок остертагнй в теле самок при
19-23аC можно считатьг :концентрацию
-диэтиламиноизобутиронитрила 5%, экспозицию самок в растворе 3 ч, среду культивирования — дехлорированную воду. Выход личинок наблкща.ется через 1-1,5 сут после гибели самок.
Пример 4. В тех же условиях изучается действие растворов р -ди.этиламиноизобутнронитрнла на самок нематод из рода Мо з%аИоц. а и Йепа—
&оИги6 . Взрослые паразиты после действия раствора гибнут в те же сроки, что и описанные виды. В теле погибшей самки в течение первых трех сут идет развитие яиц, но затем оно прекращается и яйца гибнут. Для этих видав гельминтов свойственно длительное развитие яиц и личинок в них1 или 2 линьки протекают B яйце. Личинки в теле самки для этих видов нематод не получены.
Стимуляция развития.яиц и выхода
10 личинок внутри тела самок 8 -диэтиламиноизобутиронитрилом возможна для нематод стронгилоидного типа развития.
Пример 5. Во всех опытах при 5 наблюдении за. развитием яиц в теле самки нематод учитывается также степень развития микрофлоры по сравнению с контрольными вариантами (самки нематад, содержащиеся в чашках .О с декларированной водопроводной водой, не подвергающиеся действию (-диэтиламиноизобутиронитрила).
Инагократные наблюдения показывают, что 7-15 самок, не отмытых от 5%-ного раствора Р -диэтиламиноизобутироннтрила, перенесенные в 60-8Ь мл воды, содержат достаточное количество вещества, способного подавить рост микрофлоры в среде культивирования.
В течение первых трех суток рост микрофлоры иигибируется полностью, в последующие 4-б сут развивается единичное число микроорганизмов и только спустя 7-8 сут в среде культивирования появляется незначительное их ко35 личество, не мешающее развитию личинок (табл. 2).
1020104
+ +
+
I
l ++
1 ++
+
I
I l + +
3 1
+
+ + +
1 1 I
3
3
i 3
1- ++
I ++
1.
+
1.
l . +
1 + ! ++
I
3
I - +
3 +
+ +
I .
1
3 +
1 +
I +
+
1!
+ + +
1 !
1
I
3 +
3 +
1 (°
+ +
I. I
1 1
I
l !
11 "+ I. I ..
I. l
++
+ + ! .+.А 3
Х 3
Ф 1
Ф I Р .31. О
1 . I
t М
3 g
1 Ж .t e
I !3
1 X о
t. !
Ц !
И
1 н 1
1 .А
3 !! Д 3. а О .ое н ю Ф но
O Qw, NI
Ь3 9 O 0
» н!
Cl
lA о н ь с о о
1 сч i !о
1 1 н н
I 1
Ф 1 3 ! 1
I I и I - I
I I Щ о
Ц 3 I
3 р
t . I
33 1 I
I I Еч 1 1 сЬ
I 1;
1 1
1 Г.
I I
l 53
1 ф 3 3» ! t. ! Ов—
I t ! I
М I .I РI щг.О I
1 Е 3.
1 О.3
l5 Д, Ц t x
F4.3 М 1
Н:.I
Ж 1 и I.lh 1О а 1 1 о 1н! ф I й! .i1 В i
tel.
I. Р 1. о:
Р) 1 41w и
33!Н! о 1о!
33 О.i
3: "u i
М. Ж I.
Н 1 Ф 1.В 3 Н м ъ.
5 !х!
-.1.. I
I 1
Ф- 1 — -.
1 I:
33 1. Ф
Р I 1 о
133 1 . I
El.
Ф .,I
A 1 t, 1 )..
Р3 1
Н3 (Ч
3. ..I l Phj I I 1
О 1
Д L.O 1 *
1
1 ) I. 1 1 1
1 I I I .1
1 1 .. 1 1 о ь- о о ъ ъ ° .ъ С
3Ч- .Е Ю
1 !
i
t !
1
f 1
3 а !. Q;
1 !4
1 Ф
+ 3ф о1 И
I Ф
+ 1 . N
1 l g .
3 а
1 О. о
1 g, 1
1 Ф
1 I Ж : Ф 43 .
t . Ф В .
З 33> о а 3 О. О3 ! В eked
1 Й l4М
I 3
1 .3 !
l .! +
3.! 1
° е ° ю cv ee !
Ф !
33 .! е
1 а I
l и
i в
Ф
Ф О
Ф
33 3 о
Q н х о
2. 3
gìv. р м о g
Ф 3 3;3 оо
Р 33. Ф g Мдо
1 1 1
1020104
Составитель М. Белоусова
Редактор П. Макаревич Техред A. Бабинец Корректор Ю. Макаренко
Й И Юв
Подписное
Заказ 3749/5 Тираж 721
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, й-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
В связи с этим проводят испытания различных концентраций (от 0,01 до
5,0% ) р -диэтнламинонзобутироннтрила как ингибитора микрофлоры. Результаты испытаний, представленные в табл.2, "подтверждают проведенные наблюдения. 5 р -Диэтиламиноиэобутиронитрил, стимулируя развитие яиц в самках нематод, одновременно ингибирует в среде куль.тивирования развитие микрофлоры.
Применение преднагаемого способа t0 обеспечивает ряд преимуществ в сравнении с известным, Во-первых, так как яйца развиваютсй в полости тела самки, исключается процесс потрошения и их сбор, отнима- )$ ющий, как правило, большую часть вре-.
МЕни при поотаНОВКВ ОпЫтов (2-3 рабочих дня . Кроме того, отпадает необходимость работы с микроскопическими объекТами, so-вторых, после гибели
«самок под действием P диэтиламяноичобутиронитрила в гонадах развиваются все зрелые яйца, исключена возможность их механического повреждения, обеспечен учет дефектных и незрелых яиц;
s.-третьих, нет необходимости очищать среду от .остатков тел нематод, которые, как правило, служат пищей гнилостйой микрофлоре, кроме того, на этом этапе экономится время, в-четвертых, исключается процесс открывания личинок и очистка среды от избытка микрофлоры, так как.даже в очень незначительных дозах в -диэтиламиноизобутиронитрнл сам ингибнрует рост микроорганизмов, а значит, отпадает потребность s антибиотиках и экономится время, в-пятых, так как личинки сконцентрированы в теле нематоды, исключается учет личинок неизвестного вида, что важно для диагностики личинок на разных стадиях развития этот способ дает воэможность при вырацивании личинок проводить диагностику самок (видовую) °