Способ определения степени дисперсности хроматина в ядрах клеток

Способ определения степени дисперсности хроматина в ядрах клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ДРЮПЕРСНОСТИ ХРОМАТИНА В ЯД.. PAX КЛЕТОК, включающий введение метки в хроматин ядра и регистрацию интенсивности выходящего излучения, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с цельюповышения точности и увеличения скорости измерений , вводят метку в виде изотопного источника ионизврующегх излучения, после регистрации иитенснвности выходящего излучения разрушают ядро клетки до уровня отдельных молекул, дгаюлнительно регкстрир т интенсивность шкодящего излучен1ш по соотношению результатрв HSMepei E cyofst о сгетейи дисперсносуи хроматине вяеткв. . .

.СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„, Я0.„.102201

ЗСЮ 01 N 23/00: Св 21 Н 5/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTPN

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Я ..

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ -------.— .г (21) 3368101/18-25 (22) 11.01.82 (46) 07.06.83, Bxm. Ию 21 (72) A. B. Харцишин, И. Л. Лапидус. н Д. М. Спнтковский, (71) Институт медицинской генетики . АМН СССР. (53) 539.1.06 (088 8) (56) 1,, Райков И. Б. Ядро простейщйй.;

Л., Наука, 1978, с. 39-42.

2. INrmer Р., Abmayr. M. Correlation оейиеей nuclear morfol y and rate cf

ОНА siiithesls. 1п а погаа1 sell l ine.4.Hi stechem:i stry апд Cytochemistry, 1979, ч 27, и 1, р. :188-l92 (пробс".:,т ип) . (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ПИСПЕРСНССТИ ХРОМАТИНА В ЯП

РАХ КЛЕТОК, включающий введение меткй в хроматнн ядра и регнстрацню интенсивности выходящего излучения, о т л н ч а - . ю щ и и с sтем,,что, с целью повышения точности н увеличения скорости иэмерешй, вводят метку в виде изотопного источника ионизнруище|о нзлучения, после регистрации ннтенснвностн выходящего излучения разрушают ядро клетки до уровня - отдельньцс. молекул, дополнительно регистрируют ннтеноивйость выходящего нзлучення:н-по соотношению результатов. измефенуй cygis ã о степени диспврсностн хроматнйа ядра илеса.. - Я

1022019

Изобретение относится к молекулярной биологии, позволяет определять размеры микроскопических структур и может быть использовано в различных областях биологии и медицины для анализа структур- 5 ного состояния хроматина по характеристикам его диспе зсности в ядрах клеток в норме и при патологии.

Известны способы определения степени дисперсности хроматина в ядрах клеток путем введения в хроматин ядра специфической для компонент хроматина погло;шаюшей или.флоуресцируюшей метки и визуальной регистрации выходяшего светового излучения с помощью микроско- 15 пии (1 3 .

Однакоэти способы не позволяют полу- чить метрологически достоверных результатов, поскольку основаны на субъективном характере измерений. 20

Наиболее близким к изобретению является способ определения степени дисперсности, хроматина в ядрах клеток, включающий введение флоуресцирующей метки в хроматин ядра и регистрацию ин- 25 тенсивности выходяшет оизлучения,,скани» рование исследуемой области, фотометрирование выходяшего излучения и нахождение расчетным путем параметра, характериэуюшего степень дисперсности (2 J .

Однако хотя указанный способ позволяет получить количественные результаты, точность определения параметров дисперсности с его помошью мала и ограничивается разрешаюшей способнсстью микро- З скопа, размером зонда и величиной шага сканирования. Из-за необходимости сканирования время измерения, необходимое для получения статически достоверHoI o pea ubrara, samemH продолжитель- 40 т ым. Кроме того, сведение объемного объекта к его двухмерной проекции, существенно снижает точность определения параметров дисперсности, Пелью изобретения является повыше45 ние точности и скорости измерений.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения степе- ни дисперсности хроматина в ядре клет ки, включающему введение метки в хроматин ядра и регистрацию интенсивности

: выходяшего излучения, вводят метку в виде изотопного источника ионизирующего излучения, после регистрации интенсивности выходяшего излучения раэруша|от ядро клетки до уровня отдельных молекул, дополнительно регистрируют интенсивность выходяшего излучения и по r.оотношению результатов измерений судят о степени дисперсности хроматина ядра клетки.

Предлагаемый способ определения параметров дисперсности основан на устаноь ленной зависимости уровня поглошения излучения, испускаемого включенной в состав хромагина радиоактивной меткой, от размеров гранул хроматина. При изменении размера гранул меняется величина поглошенной ими энергии ионизирующего излучения и, соответственно, меняется интенсивность выходяшего регистрируемого излучения, При полном разрушении клеток указанный эффект самопоглошения отсутствует. Сравнение уровней счета исходного препарата и разрушенного до молекулярного уровня позволяет определить величину поглошения, исходя из которой рассчитываются параметры дисперсности.

Примером реализации способа является излучение степени дисперсности хрома тина фибропластов в норме и подвергнуI bix диспергируюшему воздействию - o6работке раствором пониженной по сравнению с физиологической ионной силлой. В качестве метки использовался радиоактивный источник низкоэнергетического Ъ-излучения-тритий, который в составе Н-тимидина вводился в хроматин ядер клеток посредс твом внесения Н-тими3 дина в среду культивирования на 18-20 ч из расчета конечной радиоактивности 35 мкКи в 1 мл среды.

Клетки фиксировались, и невключившийся Н-тимидин отмывался.

Регистрация ф -излучения осушествлялась с помошью жидкостно-сцинтилляционного счетчика. Подготовленные препараты помешались в сцинтилляционный флакон с 15 мл сцинтиллятора и проводипаса регистрация излучения, При этом сцинтиллятор проникает внутрь ядер клеток и основная часть р-частиц, не потереявших свою энергию до контакта со сцинтиллятором, взаимодействует с последним внутри ядра. После регистрации осуществлялось разрушение клеток до молекулярного уровня путем гидролиза непосредственно в сцинтилляционном флаконе, причем сцинтиллятор удалялся и добавлялось 0,1 - 0,2 мл гидролизуюшего раствора.

К гидролизу добавлялось 15 мл сцинтилляционного раствора и вторично проводилась регистрация излучения. При указанном испытании получены следуюшие значения прироста скорости счета в результате гидролиэа, xapBKr .ðèëó îøèe с reСоставитель F. Сидохин

Редактор И. Николайчук Техред О.Неце . Корректор С. Шекмар

Заказ 4028/34

Тираж 873 П одписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 10 пень поглощения P -÷añrèö хроматином в ядрах клеток: фибробласты в норме—

71%, подвергнутые диспергирующему воэдейс твию — 50 4.

При использовании для расчетов формулы (1), выражающей зависимость вероятности регистрации р-частиц or размеров гранул. получены следующие сред..ние размеры гранул хроматина: фибробласты в норме — 0,50 мкм, подвергнутые диспергирующему воздействию—

0,33 мкм. р тобах пор

1 где Е„ -пороговое значение энергии регистрации;

E „ц„- максимальная энергия р-частиц;

9(a } — энергетическое распределение

Р -частиц; ((Е ) — эффективность регистрации р -частиц;

220l9 4

P (E г, - вероятность .вылета р -частиЕ ) Еро ), цы из гРанУлы РадиУса r c энергией E ) Епср.

Предлагаемый способ позволяет определять характеристики дисперсности хроматина в ядрах клеток с учетом объемной структуры образца, что повышает достоверность и точность результатов по срав нению с известными способами, предполагаю10 шими анализ двухмерной проекции объемного образца.

Кроме того, использование предлагаемого способа повышает точность резуль татов иэмеренийпри меньшей трудоемкости

15 их получения, вследствие отсутствия присущих известным способам ограничений, накладываемых разрешающей -спс собностью микроскопа (0,3 - 0,4 мкм), размером зонда и шага сканирования

20 (0,2 5-0,5 мкм), w возможности ьзмерения в одном акте регистрации паттаметров большого числа (порядка 10 ) клеток прн затратах времени на измерение около 1 мин, что значительно быстрее, 25 чем по известному способу (в расчете. на одну клетку).