Способ получения липосом

Способ получения липосом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ, включагаций смешение фосфолипидов живой ткани с действующими веществами , отличающийся тем, что,.с целью повышения органотропности , предварительно смешивают .фосфолипиды и холестерин, вьщеленные из определенного количества живой ткани, и после добавления действукицих веществ в полученную смесь вводят ганглиозиды, вьщеленные из того же количества одноименной ткани.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИН (I9l (П) 3(51) A 61 К 9/10, А 61 К 35 12

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3282930/28-13 (22 ) 06 ° 05. 81 (46 ) 30.12. 83. Бюл. М 48 (72 ) Т. С.Саатов, Э.И. Исаев, С. A. Бурханов, Я.Х. Туракулов, Д.Х.Хамидов «и Ю,П.Тихонов (71) Институт биохимии AH Уз ССР (53) 615.45(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

М 833242, кл . A 61 К 9/10, 1 979.

2. Торчилин В.П. и др. Сохранение снецифической связывающей способности антителами, ковалентно связанными с поверхностью липосом,.Доклады

Ah СССР, т. 246, 9 3, 1979. (54 ) (57 ) CIIOCOE ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ, включающий смешение фосфолипидов живой ткани с действующими веществами, отличающийся тем, что„.с пелью повышения органотропности, предварительно смешивают ,фосфолипиды и холестерин, выделенные нз определенного количества живой ткани, и после добавления действующих веществ в полученную смесь вводят ганглнозиды, выделенные из того же количества одноименной ткани.

1022357

Изобретение относится к медицине а именно к способу получения органотропных липосом, которые могут быть использованы в кардиологии, онкологии и других отраслях медицины.

Известен способ получения липосом с использованием ткани печени (1) .

Известен также способ получения липосом, включающий смешение фосфолипидов живой ткани с действующими веществами (2) .

Однако известные способы не обеспечивают получения ли с достаточной органотропностью, так как применяются липидные компоненты из различных неидентичных к данной 15 ткани фосфогликолипидов, а для создания заряда на поверхности липо. сом и придания реакционной способности применяют не встречающиеся в плазматической мембране химические вещества, вследствие чего теряется сродство липосом с природными мембранами тканей.

Целью изобретения является повышение органотропности. 25

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения липосом, включающем смешение фосфолипидов живой ткани с действующими веществами, предварительно смешивают фосфолипиды и холестерин, выделенные из определенного количества живой ткани, и после добавления действующих веществ в полученную смесь вводят ганглиозиды, выделенные из того же количества одноименной ткани.

Способ осуществляют следующим образом.

Сначала выделяют из ткани меченные фосфогликолипиды, для этого 40

Н-ацетил (4, 5, б, 7, 8, 9, 14-С ) нейтРаминовую кислоту в количестве 5 мкКи, удельной активностью 259 мКи/ммоль вводят кролику весом 3 кг внутривенно и через 1 ч забивают декапитацией,45 извлекают мозг, сердце, печень, легкие, почки, селезенку, скг етные мышцы, поджелудочную железу и экстрагируют липиды в хлороформ-метаноле (2:1) из расчета 20 мл на.1 r ткани.

Ганглиозидные фракции выделяют из общих липйдов, диализуют против дистиллированной воды и хранят при

0 С до использования. В другой .серии о опытов вводят кролику 1-С -пальмитат в комплексе с бычьим сывороточным 55 альбумином внутривенно, через час забивают животное дикапитацией и извлекают все органы, экстрагируют общие липиды по Фольчу и очищают фосфолипиды тонкослойной хроматогра - 60 фией. Органную специфичность фосфогликолипидных липосом определяют по ганглиоэидному составу тканей (см. табл. 3). Как видно иэ полученйых данных, введенные фосфолипид -C

-ганглиозидные липосомы преимущественно связываются с теми органами, из липидов которых были изготовлены органоспецифические везикулы. В органах-мишенях введенные радиоактивности накапливались в количестве от трех до десяти раз большем, чем в органах не мишенях. Извлеченные таким способом липосомы являются естественными прототипами клеток тканей.

Для того, чтобы доказать, что поверхностные ганглиозиды тканей определяют процесс узнавания клеток, были введены внутривенно кроликам

1-С -пальмитат -фосфолипидные

<4 липосомы печени без ганлиозидов и изучено их распределение по органам (см. табл. 2).

Если сравнить результаты табл. 1 и 2, то видно, что за процессы клеточногс узнавания ответственны ганглиозиды пла.=.матических мембран тканей, фосфолипид-холестериновые фракции как в липосомах, так и в естественных мембранах играют структурную роль, т.е. способствуют под,цержанию конфигурации мембран в наиболее оптимальном состоянии в уг.— ловиях in vitro и целостного организма.

На основе полученных экспериментальных закономерностей направления органоспецифических фосфолипид-ганглиозидных липосом была изучена избирательная транспортировка Н -оуабаина и 8-Н -аденозин-3 5-циклофосфата-цАМФ, инкапсулированных в липосомы в мышцу сердца.

Экстрагируют общие липиды из миокарда кролика, отделяют фосфолипиды, холестерин, ганглиозиды. Смесь фосфолипидов и холестерина, соответствующая двум граммам ткани, выпаривают от хлороформа досуха, затем добавляют

300 мкС оуабатна или цАМФ и 2 мл

Кребс-Рингер- фосфатного буфера, pH. — 7,4. встряхивают до образования эмульсии, озвучивают при 22 кГц на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1 дри 4 С 45 с в электрическом поле о

2, 5, В, диалиэуют в течение суток против дистиллированной воды. После этого к липосомам добавляют ганглиозиды сердца, выделенные из двух граммов ткани, и тщательно перемешивают. Этот липосомальный препарат вводят кроликам и через 1 ч забивают животных дикапитацией, извлекают органы, экстрагируют препараты после гомогенизации в абсолютном этаноле, центрифугируют и в супернатанте считают радиоактивность в жидкостносцинтиляционном счетчике. Полученные результаты представлены в табл. 3, 4.

Как видно иэ полученных результатов, введение оуабаина внутрь фосфо1022357

Таблица 1

Распределение фосфолипид-С 4 -ганглиозидных липосом в различных органах кролика (активность в имп/мин/г ткани) (количество опытов 4)

Исследов< нные органы активность в (имп/мин/г ткани) Активность

С14 -ганглиоэида на липосоме

Органоспецифические липосомы ткани сердце печень мозг почки

2270>156 826+87 290++21 375+-23

383066

Сердце

Печень

Мозг

270+18 4260+421 165+12 96 7,2

204 13 606+59 3240+216 305+-26

224 16 660+71 215+16 2206+159

200Й18 620+83 294 23 300326

238+19 606159 132+9 б. 154 13

243084

213356

206902

240968

225460

Почки

Легкие

Селезенка

Скелетные мышцы

84 14 63 156+18 186 +16 320 121

216816

Поджелудочная железа

268+21 408+31 211+16 206 16

215989 липид-ганглиозидных липосом способствует в 10-12 раз большему накоплению препарата в мышце сердца, а в других изученных тканях существенных отличий от контроля не отмечается.

Экзогенный цАМФ не проникает через плазматические мембраны тканей, но при окружении липидной ьеэикулой повышается сродство со структурой тканей.

Лип о сомы, содержащие ra н глио з иды, поглощаются быстрее и в большей степени, а в мышце сердца накапливаются Н -цАМФ в этих услоьиях в пять раз больше, чем без ганглиоэида, что свидетельствует о повышении органотропности и специфичности к мио-. карду.

Предлагаемый способ по сравнению с известным споособом обеспечивает повышение органотропности лекарственных препаратов с помощью фосфолипид-ганглиоэидных липосом, способствует избирательной доставке к больному месту беэ повреждения здоровых тканей.

При применении этого способа уменьшается доза введения различных

10 лекарств при равноценном достижении лечебного эффекта. Благодаря введению лекарств в липосомах уменьшается токсичность и появляется возможность для введения непроникающих препаратов внутрь клетки органа-мишени.

Способ найдет применение при лечении болезней сердца, опухолей, наследственных нарушений.

10)2357

Продолжение табл

Исследованные органы(активность в имп/мин/r ткани) Органоспецифические липосомы ткани легкие селезенка скелетные поджелудочная мымцы железа

4651 43

202+17

300+22

382+ 33

98+6,3

700„59

416 43

208+16

510+53

700" 66

3315т283

310А24

Скелетные мывцы

285 21

4220+393

507 41 226113

Поджелудочная железа

2220 193

121+7,2 492 46

2 б-+13

Примечание. Количество фосфолипидов, ганглиозидов, холестерина на липосоме соответствует 2 r ткани. Липосомы вводят в укную вену кроликов, забивают декагитацией через 1 ч. Радиоактивность определяют в общей липидной фракции исследованных органов на жидкостно-сцинтиляционном,счетчике Марк Ш.

Т а

Распределение 1-С " -пальмитат-фосфолипидных липосом

Ц в различных органах кролика (активность в имп/мин/г (Количество опытов 4) блица 2 мозга ткани).

Скелетные мышцы

Мозг Печень Сердце Селезенка ПоджелудочL ная железа

Почки

18201120 11501110 1260+135 85004460 1460 145 2650+210 1250+ 115

Примечание. Количество фосфолипидов, холестерина на липоссме соответствует 2 r ткани мозга. Вводят около 1,1 млн. имп/мин внутривенно кроликам, забой через 1 ч. Радиоактивность определяют в общей липидной фракции тканей.

Сердце

Печень

Мозг

Почки

Легкие

Селезенка

330+23

157+12

236+ 19

31 91 26

3516+ 293

229+ 16

656i56

162+ 13

480+38

435+38

480+43

285+26

1022357

Таблица 3

Распределение Н -оуабаина в органах кролика {активность в имп/мин/г

3 ткани). (Количество опытов 3) Скелетные мышцы

Показатель Сердце Печень

Поджелудочная келеза

Легкие Селезенка

Мозг Почки .

Н -оуабаин внутри липосом

38940+ 50901 1230 5690+ 1200+

2900 620 210 525 160

1120k 2300+

95 190

1730+

165

»

Таблица 4

Распределение Н -цАМФ в органах кролика.

{активность в импlминlг ткани). (Количество опытов . 3) Сердце, Печень Скелетные мышцы

Показатель

Н -цАИФ без липосом

140117 108+9,3

160+20

Н- -цАМФ внутри фосфоли9 пидных липосом

2216+175

45841350 960 85

h -цАИФ внутри фослипид3

-ганглиозидных липосом

6720+ 540 1080+110

11440+ 970

Составитель С. Малютина

Редактор Н. Коляда Техред Т.Маточка. Корректор И. Эрдейн

» « °

Заказ 10614/8 ТИраа 713 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, X-35, Раушская иаб., д. 4/5

Н -оуабанн без липосом

33501 1860k 1140 54601 1480k 1120> 1050 2950

270 125 125 460 115 80 75 265

Филиал ППП "Патент", r. Узаород, ул.Проектная, 4