Способ количественного определения биологически активного вещества

Способ количественного определения биологически активного вещества

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ КОШЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ . БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО BE- , ЩЕСТВА путем инкуба 1(ии исследуеного материала со специфической сывороткой в присутствии меченого исследуемого биологически активного вещества , взятого в определенной концентрации , с последуяицим учетом непроре-. агировавфего меченого вещества, о тл и ч а ю щ и и с я тем, что, с . целью пог11аа}ения чувствительности способа , инкубирование проводят в присутствии биологически активного веществг , меченого никотина-мидаденин динуклеотидом или аденозинтрифосфатом ..

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОИ ЛЮ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ. СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЬФ КОМИТЕТ СССР М и йй (21) 3005288/28-13 (25) 3005277/28-13 . (22) 1В; 11.80 (46) 15 06.83. Бал. М 22 (72) И.В.Березин, А.М.Егоров, Е.М.Гаврилова, А.П.Осипов, Т.Г.Митрохина, Н.И.Киселева,.C.А.Еремин, и H.Í.llonosa „ (7t) .Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного .Знамени госу-. ларственный университет им. М.B.Ломо-носова (53) @616-07(088.8) (56) 1. Руководство по иммунологии.

Под.ред.О.Е.Вязова и Т.Х.Ходжаева.

H., "Медицина", 1973,-с.330-343.

2. Патент ФРГ У 2155658, кл. 6 01 34 3316, 1975.

„SU„„1022712 А

Зав А 61 К 39/00// 6 01 и 48 (54)(57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕ"

ДЕЛЕНИЯ. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА путем инкубации исследуемого материала со специфической сыворот- . кой в присутствии меченого исследуемого биологически активного вещества, взятого в определенной концент.рации, с поаледующим учетом непроре-. агировавфего меченого вещества, о тл и ч а в шийся теи, что, с целью повыпения чувствительности способа, инкубирование проводят в .присутствии биологически активного вещества, меченого никотина-мидадениндинуклеотидом или аденозинтрифосфатом. . Я

1022712

Изобретение относится к медицине и касается способа количественного определения биологически активного вещества.

Известен способ количественного определения антигена с помощью флюоресцирующих красителей (1 ).

Известен также способ количественного определения биологически активного вещества (БАВ ) путем инкубации исследуемого матери ла со специфической сывороткой в присутствии меченого исследуемого 6АВ, взятого в определенной концентрации с последующим учетом количества непрореагировавшего меченого вещества. Чувствитель-з ность для стероидных гормонов 10 м, для инсулина 10 м Г2).

Однако известный способ не обеспечивает высокой чувствительности способа.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Цель достигается тем, что согласно способу количественного определения биологически активного вещества путем инкубации исследуемого материала со специфической сывороткой в присутствии меченого исследуемого биологически активного вещества, взятого .в определенной концентрации, с последующим учетом количества непрореагировавшего меченого вещества, инкубирование проводят в присутствии биологически активного вещества, меченого никотинамидадениндинуклеотидом или аденозинтрифосфатом.

Меченое НАД БАВ получают путем модификации НАД по С - аминогруппе аденинового кольца с последующим связыванием модишицированного кофермента с БАВ карбодимидом.

Il р и м е р 1. Определение инсулина.

Построение калибровочной кривой для определения инсулина в растворе.

1 мл раствора инсулина в фосфатном буфере рН 7,8, содержащем стандартные количества (0,05; О, 1;

0,5; 1,5; 10; 20; 40; 60; 100 и

200 нм инсулина, инкубируют с

200 мкл имунной сыворотки морской свинки против инсулина свиньи, разведенной в 1000 раз и 1 мл !О М раствора комплекса НАД - инсулин (никотинамида-дениндинуклеотид-инсулин) в течение 2-25 мин при 25 С.

После инкубации 0,1 мл раствора инкубационной смеси вносят в кювету спектрофотометра, содержащую 1,9 мл

0,05 M калий-фосфатного буфера рН 7,4,0,1 мл смеси НДМА (паранитрозо-N М-диметиланилин) и циклогексанола/НДМА растворяют в циклогек - саноле до концентрации 40 мМ,а за-! л тем разбавляют 0,05M калий-фосфатным буфером до концентрации

300 мкМ/мл и 0,1 мл алкоголегидрогенаэы. Измеряют убывание восстановленной формы НДМА по изменению опти1 ческой плотности при 440 нм. Калибровочная кривая представлена на фиг.1

Определение инсулина осуществляют следующим образом.

1 мл сыворотки крови человека, разведенной в 10 раз калий-фосфатным буфером, инкубируют с 200 мкл сыворотки морской свинки, содержащей антитела к инсулину, разведенной в !

00 раэ и 1 мл 10 " М раствора НАДд инсулин, после чего вносят в кювету спектрофотометра для измерения скорости восстановления НДМА. Все остальные реагенты добавляют в тех же соотношениях, что и при построении калибЗп ровочной кривой. Определяют концентрацию инсулина по калибровочной кривой.

Пример 2. Определение !7- -зкстрадиола.

Для построения калибровочной кривой 1 мл раствора 17Р-экстрадиола в 0,05 М калий-фосфатном буфере (:рН 7,8}, содержащий стандартные количетсва (0,4; 0,8; 1; 1,5; 2,10; 20;

<и 50 и 100 нг) инкубируют с 1 мл !О

М раствора комплекса НАД- 17- -экстрадиола с бычьим сывороточным альбумином (БСА)„ разведенным в 100 раз, в течение .20 мин при 25 C. Доза и раз ведение антисыворотки подбирают по ингибированию скорости восстановления НДМА на 603.

Определение 17-f3- зкстрадиола осуществляют аналогично примеру 1.

Чувствительность определения биологически активных веществ достигает 1О -10„ М, в частности для ин-12-. сулийа 10 -"М.

Для получения комплексов аденозинтрифосфат (АТф) с БАВ АТФ предварительно модифицируют до АТФй -N -(6- аминогексил}-ацетамида и затем ковалентно связывают с соот;ветствующим биологически активным

1022712 веществом в присутствии растворимого карбодиииида.

Пример 3. Определение инсулина. Построение калибровочной кривой. 1 ил раствора инсулина в 0,1 И трис- ацетатнои буфере (рН 7,8), содержащем стандарнтные количества (5; l0; 20; 40; 60; .100 и 200 нг) инсулина инкубируютсо 100 мкл иммунной сыворотки морской свинки против ин- 1О сулина свиньи, разведенной в 1000 раз и 1 мл 10 И раствора комплекса

АТФ-инсулин в течение 20-30 мин при

3? С.

Для работы используют обьем и разведение исходной антисыворотки; вызывающей ингиби ование биолюминес- . ценции 1 мл 10" И раствора комплек- о са АТФ-инсулин íà 8% .

После инкубации 0,5 ил реакционной смеси вносят в кювету биолюминометра, содержащую 1 ил 0,1 М трисацетатного буфера, рН 7,8; 0,2 мл

0,1 И раствора Иц30, 0,2 ил 0,4 иИ . раствора.люцеферина и 0,2 мл раствора люцефиразы в том же буфере и измеряют интенсивность биолюминесценции. Калибровочная кривая пред- Зо ставлена на фиг.2.

Ilo получении калибровочной кривой может быть определено содержание ин- сулина в образце биологической жидкости, 1 мл сыворотки крови человека, разделенной в 10 раз.(0,1 мл сыворотки и 0,9 мл трис-ацетатного буфера, рН 7,8) инкубируют со 100 мкл имунной сыворотки морской свинки, =so разведенной в 1000 ваз, и 1 мл 10 И раствора комплекса АТФ-инсулин в течение 20 мин при 37 С, после чего

0,5 мл реакционной сиеси вносят в кювету для измерения интенсивности биолюминесценции. Все остальные ревгенты добавляют в кювету в тех же соотношениях, что и при построении

:калибровочной кривойЛ1о полученному значению интенсивности с помощью калибровочной кривой определяют концентрацию инсулина. Чувствительность определения около 10 И.

42

Пример 4. Определение концентрации ампициллина.

Для проведения иммунной реакции используют антисыворотку, полученную к конъюгату ампициллин-бычий сывороточный альбумин (БСА), доза и раз- . ведение которой подбирают экспериментально в зависимости от активности и титра антител. В качестве меченого стандарта используют 10 .И раствор комплекса АТФ-ампициллин.

Использование способа йоэволяет повысить чувствительность определения, сократить время проведения анализа.

1022712

z Ю н фация иауиина, ни м ,бам. 8 ю суиг

Составитель Г. Смирнова

Редактор Г.Гербер Техред А.Бабинец Корректор Ю.Макаренко

Заказ 4098/3 Тираж 713 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 е филиал Illlll "Патент", r. Ужгород; ул. Проектная, 4