Способ количественного определения целлюлозы

Способ количественного определения целлюлозы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ путем обработки анализируемой пробы целлюлозогидролизукнцим ферментным препаратом с последующей обработкой полученной смеси реактивом Шамоди-Нельсона и спектрофотометрированием окрашенного раствора, отличающийся тем, что, с целью снижения предела обнаружения и упрощения технологии определения, пробу предварительно размалывают и обработку осуществляют, ферментным препаратом, выделенным :из культуры Geotrichum candidum 3с, при рН tt,Q-k,B и 45-50 С. О N:) а:

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СРЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (!9) (11) ЗСЮ а 01 Н 33 46 G 12 1 34

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 5 -:„ . дцфФщу

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 3405409/23-05 (22 ) 10. 03.. 82 (46) 07.07.83. Вюл. Р 25 (72 ) A.A.Тумайов и R.A. Коростылева (71) Научно-исследовательский институт химии при Горьковском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете им, Н.И.Лобачевского (53) 543.854.748(088 ° 8) (56) 1. Schramm М., Hestin Sh.1

А novel method for the determination

of cellulose. - Biochem. J, v. 56, р. 163, 1954.

2. Авторское свидетельство СССР

Р 82623ф, кл. G 01 N 33/46„ 1981 (прототип).

-(54)(57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛК)ЛОЗЫ путем обработки анализируемой пробы целлюлоэо- гидролиэующим ферментным препаратом с последуюцей обработкой полученной смеси реактивом Шамоди-Нельсона и спектрофотометрированием окрашенного раствора, отличающийся тем, что, с целью снижения предела обнаружения и упрошения технологии определения, пробу предварительно размалывают и обработку осуцествляют, ферментным препаратом, выделенным из культуры Geotrichum candidum Зс, при рН 4,0- 4,8 и 45-50 С.

1027614

Изобретение относится. к аналитической химии, а именно к способам количественного определения целлюлозы.

Известен способ определения малых количеств бактериальной целлюлозы, основанный на ацетолизе предварительно очищенного образца, кислотном гидролизе полученного продукта и ко» лориметрическом определеиии войской», навливающих- сахаров с медным реаген- 10 том (1 «3.

Недбстатки способа — длительность и сложность обработки, недостаточная, избирательность и высокий предел обнаружения. 15

Наиболее близким к предлагаемому является способ количественного. определения целлюлозы и целлюлоэных микроорганизмов путем обработки аналиэируемои пробыфильтратом культураль 0 йой жидкости бактерии Бог. cellulo:-um при рН 3-5 и 40-45 C с последу>ющим спектрофотометрическим определением образующихся в результате ферментативногс гидролиза редуциру" ющих веществ методом Иамоди-Нель. сона t 23.

Однако способ обладает недостаточно низким пределом обнаружения (0,01 мг/мл), сложностью и длительностью подготовительных операций (необходимость. постоянного культивирования культуры Бог. cellulosum).

Цель изобретения — снижение предела обнаружения и упрощение технологии определения; 35

Поставленная .цель достигается согласно способу количественного определения целлюлозы путем обработки анализируемой пробы целлюлозогид ролиэующим ферментным препаратом с 40 последующей обработкойполученной смеси реактивом Шомоди-Нельсона и спектро фотометрированиемокрашенного раствора, при котором пробу предварительно разму лывают и обработку осущестнляют 45 ферментным препаратом, выделенным из культуры Geotrichum candidum"

3 С при рН 4,0-4,8 и 45-50 С.

Предварительная обработка анализируемой пробы приводит к переходу целлюлозы B легкогидролизуемое состояние, а использование ферментного препарата позволяет упростить и стан дартиэировать процесс (активность ферментного препарата в течение длительного времени остается неизменной). Раствор ферментного препарата иэ гриба Geotrichum candidum Зс Готовят, заливая навеску соответствующим объемом ацетатного буфера (pH 4,0.); интенсчвно перемешивая .на магнитной мешалке (15 мин), затем центрифугируют при 8000 об/мин (15 мин). Готовят раствор в день определения.

Раствор Шамоди готовят соединением четырех объемов раствора 1 (12 в 65

Результаты для построения калибровочного графика приведены в табл. 1.

Таблица 1

Оптическая плот- Содержание целность при 508 нм, люлозы, мг/мл

3= 0,5 см

0,06

0,10

0„16

0,05

0„10

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

0,31

0,46

0,60

0 175

Результаты определения целлюлозы приведены в табл. 2. гартрата натрия, 24 г Иа СО (безв. ), 16 г NaHCO, 14 г Na SO довести до

800 мл водой) и одного объема раст.вора 2 (,2,4 r СиЯО - 5НйО и 3,6 г

Ма 80. в 200 мл воды) .

Реактив Нельсона готовят растворением 25 г молибдата аммония в

450 мл воды, добавлением 21 мл концентрированной серной кислоты, 3 г мьпаьяковокислого натрия в 25 мл воды и доведением объема до 500 мл. Растзор перед употреблением выдерживают

48 ч йри 37ОС. Хранится раствор в течение длительного времени, Построение калибровочного графика определения целлюлозы.

B термостатированную при 50 С ячейку помещают порошок предваритель но размолотой на вибромельнйце целлюлозы (0,005-5,00 мг) и заливают

5 мл раствора ферментного препарата

Оео1гichum candidum Зс.

В результате сухого размола на .вибрационной мельнице в .течение

30 мин получают тончайший белый порошок с размером частиц до 200 мкм.

Процесс ферментативного гидролиэа проводят при постоянном перемешивании в течение 1 ч (время контроли руют с точностью +10 .с). Раствор центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 мин, отбирак)т 1 мл раствора и определяют образовавшиеся ,редуцирующие вещества по методике

Мамади-Нельсона.

На чертеже представлен калибровочный График зависимости образоВавшихся в результате ферментативного гидролиза редуцирующих веществ (по оптической плотности окрашенного раствора) от содержания целлюлоэь

1027614

Таблица 2

Таблица 3

Пределы обнаруже ни я, мг/мл

Температура, ОС

Целлюлоза, мг/мл

«I »

Вв еде но Найдено

» « I

0,001+0,0001

0,022+ О, 002

0,051+0,004

0,10 0 007

0,10 - -1,20

0,05 - 1,15

0,02 - 1,10

0,001 - 1,00

0,001 — 1,00

0,02 » 0,70

0 001

0,020

0,050

0,10

0,20

0,50

0,70

1,00

40

0,21»0,01

0,48+0,03

0, 72+ 0;04

1,04+ 0,09

1

Наибольшая чувствительность и максимальный диапазон определяемых содержаний обеспечиваются при проведении процесса при 45-50 С.

П р и м е ч а и и е. б,oL0,95. 20 Пример 3. Способ осуществлю ется по примеру 1, но при проведении

Пример 1. В термостатиро- ферментативного гидролиза варьируют ванную при 50 С ячейку помещают 1 мг рН среды от 3,6 до 6,0 . порошка предварительно размолотой Зависимость пределов обнаружения на вибромельнице целлюлозы, заливают 25 целлюлозы от рН среды при проведении

5 мг раствора фермента (рН 4,0, Ферментативного гидролиза показана

0,2 мг/мл целлюлозы) и проводят фер- в табл. 4. ментативный гидролиэ в течение 1 ч Таблица 4 при .постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (продолжи- рН Пределы обнаружения, .тельность гидролиза контролируют се- Mr/мл кундомером ).

Раствор центрифугируют при

8000 об/мин 10 мин и определяют ре- 0,85 дуцирующие вещества. С этой целью 1,00 к 1 мл раствора добавляют 1 мл раствора Иамоди и.кипятят смесь на водя- 1,00 ной бане 15 мин. Охлаждают и добав1,00 ляют 1 мл реактива Нельсона, доводят дистиллированной водой до 10 мл и 0,90 после перемешивания колориметрируют

4О

0,80 на спектрофотометре CC-16 при 508 нм в кювете с длиной грани 0,5 см. Раст 6,0 0,75 вором сравнения служит вода, прошедшая ту же обработку. Оптическая плотность (0,16 ), определенная этим способом, соответствует 0,2 мг/мл целлюлозы (согласно ранее построен- Из табл. 4 следует, что рН 4,0ному калибровочному графику} . 4,8 при проведении ферментативного

П р и и е р 2. Способ осуществля- гидролиза обеспечивает максимальный ют по примеру 1, но при проведении 5О диапазон определяемых содержаний и ферментативного гидролиза варьируют наибольшую. чувствительность, .температуру от 30 до 60 С. Предлагаемый способ позволяет

Зависимость пределов обнаружения снизить предел обнаружения целлюлозы целлюлозы от температуры проведения с 0,01 мг/мл (известный способ) до ферментативного гидролиэа показана в 55 0,001 мг/мл и упростить технологию табл. 3. определения целлюлозы.

Составитель А. Вакула

Техред Т. фанта.0,01

0,001

0,001

0,001

0,01

0,01

Oi01

3,6

4,0

4,4

4,8

5,2

5,6

Редактор С. Юско

Тираж 873

Заказ 4730/48

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4