Способ определения активности протеаз

Способ определения активности протеаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ путем совместного инкубирования люциферазы с исследуемой пробой с последующим измерением биолюминесценции инкубационной среды, отличающийся тем, что/ с целью, ускорения и повьоиения точности способа, в инкубационную смесь предварительно вносят восстановленный никотинамидадениндинуклеотид флавйнмононуклеотид оксидоредуктаэу и ее субстраты, а исследуемую пробу добавляют после установления стабиль ,ного уровня свечения.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК. (1% (11) 3(59 G 01 N 33 48

l 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 0THPb ТИЙ (21) 3311598/28-13 (22) 30. 06.81 (46) 07. 07.83. Бюл. Р 25 (72) В.H. Петушков, Г.A. Кратасюк, A,Ì. Фиш и И.И. Гительзон (71) Институт Физики им. Л.В. Киренского (53) 616.07(088.8) (56) 1 . Лукава Л.М,, Федорова Л,Г °

Гребешкова P.Н. Прикладная биохимия и микробиология. Т. 9, вып. 4 с ° 628633 .

2. N jua D., BaPo0vin T.O., Нав

ting G.N. AnaCyt Biochem. 1974, с. 280-287. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ AKTHBHQCТИ ПРОТЕЗ путем совместного инкубирования люциферазы о исследуемой пробой с последующим измерением биолюминесценции инкубационной среды, отличающийся тем, что, с целью, ускорения и повышения точности способа, в инкубационную смесь предварительно вносят восстановленный никотинамидадениндинуклеотид флавчнмононуклеотид оксидоредуктазу и ее субстраты, а исследуемую пробу добавляют после установления стабиль, ного уровня свечения.

102761 5

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в технической микробиологии и медицинской диагностике.

Известен способ определения активности прото lз путем гидролиза белка каэеината натрия препаратом фермента, который помещают в исследуемый раствор с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой, 10

В полученном фильтрате определяют количество прогицролизованногo белка по содержанию образовавщегося тирозина колориметрическим методом с применением реактива 4>олина (1 ). 15

Однако известный способ трудоемок, многОГ тади*ен за нимает много времени

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности протеаз путем совместного инкубирования люциферазы с исследуемой пробой с последующим измерением биолюминесценции инкубационной среды (2 ).

Недостатком способа является отсутствие непрeрь>вноcти процесса апре- 5 деления протеолитической активности, для измерения необходим многократный отбор небольших по объему проб, что неизбежно приводиz к большим ошибкам в определении активности протеаз.

Кроме того, для определения протеолитической активности по известному способу необходима дополнительная графическая обработка получаемых данных, что вносит дополнительную ошибку

;в определении величины протеолитичес-З5 кой активности и не позволяет автоматизировать этот процесс.

Цель и",ñC>)>åòeíèÿ - ускорение и повышение точности способа, Поставленная цель достигается 4О согласно способу определения активности протеаз путем совместного инкубирования люциферазы с исследуемой пробой с последующим измерением биолюминесценции инкубационной среды, при котором H инкубационную смесь предварительно вносят восстановленный никотинамидадениндинуклеотид флавинмононуклеотид оксидоредуктазу и ее субстраты, а исследуемую пробу добавляют после установления стабильного уровня свечения, Способ осуществляется следующим образом, Для определения активности протеаэ сливают вместе люцифераэу, NaDH, FNN-оксидоредуктазу, альдегид, FNN u NaDH. Ьлагодаря избытку ИаВН и работе NaDH .FMN-оксидоредуктазы создается стационарная концентрация субстрата люциферазы-РЫКН2, как

60 следствие этого — стабильный уровень свечения, После добавления в полученную смесь протеазы наблюдается падение люминесценции, обусловленное инактивацией люциферазы под действием65 протеазы. Падение люминесценции можно измерять непрерывно, без дополнительного отбора проб, если полученный образец инкубировать непосредст— венно в кювете прибора для измерения свечения, детекторной частью которого является фЭУ, сигнал с которого подается на самопишущий потенциометр с известной скоростью протяжки масштабной ленты, Протеолитическую активность при этом определяют по константе инактивации люцифераэы, которую вычисляют по следующей формуле:

Еп2

6 )(2 где t q/2 — время, необходимое для уменьшения биолюминесдентной актив-ности на 50%, мин.

Для учета неспецифической инактивации люциферазы измерение проводят в отсутствии протеазы. Активность протеазы определяют разностью между константами инактивации люцифераэы в присутствии и отсутствии протеазы.

Пример 1 . Используют в качестве протеазы сухой препарат трипсина иэ поджелудочной железы быка с удельной активностью 40 ед, на

1 мг препарата и частично очищенный препарат люциферазы из Phatobacte.

rium phosphoreum, содержащий и

NaDH,"FNN-оксидоредуктазу„

К образцу, содержащему 400 мкл

0„1 буфера, 20 мкл ферментногo препарата (О, 3 мг/мл лю. ифераза с

Иа1>Н: FMN-оксидоредук хазой) 50 мкл

FMN 6 6 10 M и 50 мкл 0 005%ногo раствора миристинового альдегида, дсбавляют 300 мкл NaDH 2,68 10 4 N. (После достижения стабильного уровня биолюминесценции (10 сек) добавляют

50 мкл раствора трипсина (конечная кон>4ентрация 12,. 5 мкг/мл) . Измерение биолюминесценции проводят в термостатированной кювете при 30 С, Для учета неспецифической инактивации люциферазы проводят эксперимент без добавления трипсина.

Константу инактивации люциферазы рассчитывают по формул

Рп 2.

t ((2

Константы инактйвации люцифераэы

В ОтсуTGTBHH и Б присуxcTBHH трипсина составляют 4, 62-10 2мин-" и

2,31 мин-1, соответственно, Аналогино подсчитывают константы инактивации для других концентраций трипсина, Предлагаемый способ обеспечивает непрерыв ность процесса измерения, упрощается процедура в целом и позы1027615 шается точность определения актИв- +53, что в два раза меньше ошибки; ности протеаз, при атом константы .йолучаемой в известном способе инактивации определяются с точностью (+10%)Составитель С. Малютина

Редак тор С . Юско Техред С, Мигунова . Корректор > ° Повх

Заказ 4730/48 Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб. д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. уигород, сл, Проектная, 4