Нитрофенилдисульфидное производное сшитой агарозы в качестве хемосорбента для изучения белок-белкового взаимодействия и способ его получения

Нитрофенилдисульфидное производное сшитой агарозы в качестве хемосорбента для изучения белок-белкового взаимодействия и способ его получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. Нитрофенилдисульфидное производное сшитой агароэы формулы R)-omjCHCHj, $ciijCttcacHj- $рСИ . ЛО (Ж сшитая 10 вес.% 2,3-да1бромпропан71-ола агароза формулы работки сшитой 10 вес.% 2,3-дибром- , пропан-1-ола агарозы эпихлоргидрином. 1 4-дитиб-2,3-диоксибутаном, в водной среде при рН 7,2-8,5, затем водным раствором 2-меркаптоэтанола и после промывки полученного производного раствором нитрофенилсульфенилхлорида в уксусной кислоте при соотношении лиитой агарозы, эпихлоргидрина, 1,4-дитио-2,3-диоксибутана и нитрофе №лсульфенилхлорида, равном 1000:30500:1-20:10-200 .

!

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ

0K . сы;! а — Ск — снок

0! (21) 3332352/23-05 (22)17.06.81 (46)15.07.83. Бюл. Р 26 .(72)В. И. Лозинский, Т. О. Головина,.

Е. С. Вайнерман и С. В. Рогожин. (71)Ордена Ленина институт элементоорганических соединений им. A.Н.Несмеянова (53)547.458(088.8) (56)1.Royer, G. P.>Izeda S-i, Aso К.

{.ross-linking of revers{о1у inmobilized enzymes. - &ЕВ5 Zett, 1977, V. 80

Р 1, р. 89-94. с размерами пор в набухшем состоянии, обеспечивающими пределы исключения по белкам до 4.10 дальтон . ч

У по полисахаридам — до 2.10 дальтон, что соответствует гидцодинамическому диаметру пор .до 500 А, в качестве хемосорбента для изучения белок-белкового взаимодействия.

2. Способ получения нитрофенилдисульфидного производного сшитой агарозы путем последовательной об9{58 С 08 В 37 00, В 01 20 24 (54) <НИТРОФЕНИЛДИСУЛЬФИДНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ СШИТОЙ АГАРОЗЫ В КАЧЕСТВЕ XENOCOPBEHTA ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛОК-БЕЛКОВОГО

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ. (57) 1. Нитрофенилдисульфидное производное сшитой агарозы формулы

®-01Й СИСКфСК бИЖН ф

2 2

{K 3m 0К З02 еде(Ц- сшитая 10 вес. В 2,3-дибромпропан-1-ола агароза формулы работки сшитой 10 вес.Ъ 2,3-дибромпропан-1-ола агарозы эпихлоргидрином

1,4-дитио-2,3-диоксибутаном в водной среде при рН 7,2-8,5, затем водным раствором 2-меркаптоэтанола и после промывки полученного производного раствором нитрофенилсульфенилхлорида ° в уксусной кислоте при соотношении вышитой агарозы, эпихлоргидрииа, (,4-дитио-2,3-диоксибутана и нитрофеюилсульфенилхлорида, равном 1000:30"

500:1-20:10-200.

1028679

Изобретение относится к химической технологии, конкретно к хемосори бентам для изучения белОк-белкового взаимодействия и способам получения таких хемосорбентов и может быть использовано в научных исследованиях по химии и физической. химии белков, в энзимологии и молекулярной биологии.

Известен хемосорбент, который использовался.для получения стабилизированного внутримолекулярными сшивками папаина и для изучения взаимодействия между различными группировками в молекуле этого белка 5 13. . Нг

15 нснсн,сн.,соннснснт-сС QQ, Г !

CH C0GK . C08HCH)C00H гие®- сшитый агарсеиый гель (цй-се20 фароза) .

Преимуществом хемосорбента является то, что в качестве исходной матрицы для него используют поперечно-сшитый гель агарозы — ЦЛ-сефароза, который в процессе производства подвергается щелочному десульфированию, что приводит к удалению сульфогрупп примесного агаропектина с полисахаридной основы. В данном продукте полимерные цепи ковалентного сшиты, поэтому имеется воэможность путем постепенного введения дегидратирующего органического растворителя убрать из геля воду и затем высушить его, что в дальнейшем дает воэможность значительно повысить точность количественных экспериментов.

Однако емкость данного хемосорбента по активным группировкам 4(( (3,9 мкмоль/мл ) значительно выше необходимой„ структура промежуточной группировки (так называемой "ножки") содержит ионогенные группы: катионообменные (СООН У и анионообменные (третичные аминные), активирующие дисульфидные связи хемосорбента пиридильных группировок также обладает анионообменными свойствами.

Способ получения известного хемосорбента включает следующие стадии:

1. Окисление UJI-сефарозы периодатом натрия для получения носителя с альдегидными группировками.

2. Присоединение к носителю прир6дного пептида глутатиона с образова нием на носителе альдиминных структур.

3. Восстановление этих альдиминных группировок действием натрийборгидрида, удаление избытка восстановителя от полученного тиолпроизводного.

4. Обработку тиолпроизводного

2,2-дипиридилдисульфидом с целью получения способных к тиол-дисульфид- 65 ному обмену 2-пирйдилдисульфидных группировок хемосорбента.

К недостаткам данного способа относится неоднозначность получаемых результате синтеза структур, поскольку при Обработке альдегидного производного ЦЛ-сефарозы глутатионом реакция идет не только по AH -группам последнего, но и по тиольным группам. Вследствие этого, образуются не только необходимые структуры, но и нежелательные продукты побочной реакции — структуры с глутатионом, присоединенным-к матрице сульфидной связью.

Цель изобретения — повышение точности, экспериментов при изучении белок-белкового взаимодействия.

Указанная цель достигается структурой нитрофенилдисульфидного производного сшитой агарозы формулы где R - сшитая 10 вес.Ъ 2,3-дибромпропан-1-ола агароза формулы

0 г с размерами пор в набухшем состоянии, обеспечивающими пределы исключения по белкам до 4.10 дальтон, по полисахаридам — до 2.107 дальтон, что соответствует гидродинамическому диаметру пор до 500 й. (Нитрофенилдисульфидное производное сшитой агарозы получают путем

:последовательной обработки сшитой

10 вес.Ъ 2,3-дибромпропан-1-ола агарозы эпихлоргидрином, 3.,4-дитио-2,3диоксибутаном в водной среде при рН 7,2-8,5, затем водным раствором

2-меркаптоэтанола и после промывки полученного производного — раствором нитрофенилсульфенидхлорида в уксусной кислоте при соотношении сшитой агарозы, эпихлоргидрина, 1,4-дитио»»2,3-диоксибутана и нирофенил, сульфенилхлорида, равном 1000:30000 г 1-20: 10-200.

3 1028679

Последовательность химических пре- .хемо орбента изображена на схевращений при получении предлагаемого ме:

C1CH2CK H2„, 1) HSCH2 СНСКСКфН

1б -

0 Н0 ОК

a -OK В -0(H I -H

tOE-) 2 Y 2 2) (Н) — SQ1/Асои

- ® — ОСК СНСКфСК СКСНСНу$Х

I I

Схема синтеза разработана таким образом, чтобы исключить неоднозначность .получаемых структур, а использо вание на каждой стадии точно рассчитанного количества реагентов обеспечивает необходимую емкость хемосорбента по активным функциональным 20 группировкам.

Синтез проводят следующим образом.

Исходную матрицу - ЦЛ-сефарозу обрабатывают в щелочной среде эпн- 25 ,, хлоргидрнном с целью введения на полисахаридную основу эпоксигрупп, причем используется весовое соотношение ЦЛсефароза (сухая ) — эпихлоргидрин, равное 1000:30-600. 30

Далее при рН 7,2-8,5 при комнатной температуре обрабатывают эпоксипроизводное ЦЛ-сефарозы в водной среде дитиотреитом (ДТТ). Количество реагента расчитано таким образом, чтобы в получаемом тиолпроизводном содержалось бы 0,01-0,2 мкмоль $Нгрупп на 1 мп геля. Поэтому эпоксипроизводное обрабатывают .ДТТ при весовом соотношении ЦЛ-сефароза — ДТТ, равном 1000з1-20. Время реакции 4- 4()

24 ч. После отмывки от -продуктов реакции проводят обработку тиолсодержашего носителя большим избытком !

1000-кратным) 2-меркаптоэтанола (2-МЭ), чтобы обеспечить полное вос- 45 становление всех тиольных групп и . блокировать возможно оставшиеся эпоксигруппы.

Последнюю стадию в синтезе — активацию тиольных групп носителя — про- 50 водят обработкой в среде уксусной кислоты избытком нитрофенилсульфенилхлорида по методике получения смешанных дисульфидов из тнолов и сульфенилхлоридов. Используют весо- 55 вое соотношение ЦЛ-сефароза — ннтро.фенилсульфенилхлорид, равное 1000:

10-200. После окончания реакции и отмывки геля от реагентов проводят по:следовательную промывку целевого хе- 6О мосорбента дегидратирующими органическими растворителями и сушку продукта.

Пример 1. Влажный промытый дистиллированной водой гель ЦЛ-сефа- 65! розы в количестве, соответствующем

3 r сухого материала, помещают в колбу и заливают 50 мл 0,1 í. NaOH. При интенсивном перемешивании вносят

90 мг эпихлоргидрина и нагревают реакционную массу при интенсивном перемешивании 2 ч нри 55-60 С. Далее переносят нерастворимое вещество на стеклянный фильтр, промываЮт его на фильтре 0,1 н ° NaOH (2х50 мл ), бидистиллированной дезаэрированной водой до нейтральной реакции и затем промывают 0,06 M Ка-фосфатным буфером с .рН 7,2 (2х50 мл). Влажный гель помещают в колбу, добавляют 100 мл того же буфера и 3 мг ДТТ. Реакционную массу перемешивают 4 ч при комнатной температуре. Затем нерастворимый

,продукт промывают на фильтре тем же буфером (2х50 мл), бидистиллированной цезаэрированной водой "до нейтральной реакции, 0,1 í. HCI (2х50 мл), такой же водой до нейтральной реакции. Помещают промытый гель в колбу, заливают буфером и прибавляют 3 мп 2-МЭ. Перемешивают суспензию 2 ч при комнатной температуре. Вновь переносят вещество на фильтр, промывают бидистиллированной дезаэрированной водой до отсутствия тиолов в промывках и суспендируют гель в 50 мл раствора 30 мг нит-, рофенилсульфенилхлорида в уксусной кислоте. Перемешивают реакционную массу 2 ч при комнатной температуре.

Нерастворимый продукт отфильтровывают, промывают на фильтре- уксусной кислотой (2х50 мл ), 0,1 н. НС1(50мл), бидистиллированной водой до нейтральной реакции, 10%-ным МеОН

j(2x50 мм),50%-ным МеОН (2x50 мя), 80%-ным МеОН (2х50 мп),МеОН(5х50 мп), смесью Ne08 — ацетон 1:1 (2х50 мп) и ацетоном (0,5 л). Сушат вещество в вакуум-эксикаторе над СаС12 при

0,1 торр.

Выход 2,82 х, Иабухаемость продукта в Ъоде 26 мл/г. Емкость полученнОго хемосорбента по нитрофенилдисульфидным группировкам, найденная фотометрическим анализом при исчерпывающем восстановлении точной навески вещества избытком 2-МЭ в водном буфере при рН 7,4, составляет

0,26 мкмоль на грамм сухого,или

1028679

ВНИИПИ Заказ 4890/2 2 Тираж 494 Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

0,01 мкмоль на 1 мл набухшего геля.

Спектр поглощения раствора, получен,ного в ходе этого определения, характерен для нитротиофенола(„= 413 нм), что подтверждает наличие на нерастворимом носителе нитрофенилдисуль5 фидных группировок, Пример 2. Все операции синтеза те же, что и в примере 1, при загрузке: ЦЛ-сефароза 3 г, эпихлор,гидрин 0,9 r ДТТ 30 мг, нитрофенилсульфенилхлорид 0,3 г, время обработки эпоксидированного производного дитиотреитом 16 ч, рН 8,5.

Выход 2,90 г, емкость хемосорбента по активным нитрофенилдисуль- . 15 видным группировкам 0,1 мкмоль/мл.

Пример 3. Операции синтеза проводят по примеру 1, при загрузке:

ЦЛ-сефароза 3 r, эпихлоргидрин 1,8 r, ДТТ 60 мг, нитрофенилсульфенилхлорид 0,6 г, время обработки эпоксидированного производного дитиотреитом 24 ч, рН 7,8.

Выход 2,92 г, емкость хемосорбента ufo активным нитрофенилдисульфидным25 группировкам 0,2 мкмоль/мл.

Пример 4. Регенерация ис- . пользованного сорбента.

Хемосорбент, полученный по методике примера 2 и использованный при изу. О чении белок-белкового взаимодействия на примере исследования самоассоциации бычьего сывороточного альбумина„ после элюирования белка помещают в колбу, заливают буфером: 0,1 М трисНС1 — 0,3 М КС1 — 10 мМ ЭДТА — Oi1M

2-МЭ (рН 7,8) и перемешивают при комнатной температуре 4 ч. Далее переносят гель на стеклянный фильтр и промывают его тем же буфером (2х50 мл), бидистиллированной водой до отсут- 4О ствия тиолов в промывках и затем обра. батывают раствором нитрофенилсульфенилхлорида в уксусной кислоте, отмывают и высушивают, как и при синтезе этого хемсорбента по примеру 2. Ем- 45 кость регенерированного хемосорбента

0,1 мкмоль/мл.

С помощью хемосорбентов, получение которых описано в примерах 1-3, проводят изучение белок-белкового 5Q взаимодействия в таких, системах, как в раэноименно заряженные субединицы элестина, бычий сывороточный альбумин { самоассоциация за счет белокбелкового нековалентного взаимодействия} и др.

Полученный согласно изобретению хемосорбент щ я иьучения белок-белнового взаимодействия обладает по сравнению с известными хемосорбентами того же назначения следующими преимуществами.

Хемосорбент, отвечающий предлагаемой формуле, имеет только гидрофильные неионогенные структуры, т.е. не содержит ни ионогенных, ни гидрофобных группировок, вследствие чего неспецифическая сорбция белков в пределах ошибки измерений практически отсутствует.

Отсутствие ионогенных группировок позволяет проводить исследования процессо- электростатического взаимодействия в белковых системах с ис-. пользованием буферных растворов низкой ионной силы, что не препятствует проявлению электростатических взаимодействий у таких слабых полиэлектролитов, как белки.

Хемосорбция Н-содержащих белков на хемосорбенте нацело обратима при добавлении восстановителя.

Емкость по активным функциональ ным группировкам лежит в пределах оптимальной для изучения взаимодействий в белках величины 0,010,2 мкмоль/мл.

Активирующие дисульфидные функции хемосорбента нитрофенильные группировки неионогенны и не служат, как у известного хемосорбента того же назначения, источником нежелательного ионного обмена.

Матрица хемосорбента гидрофильна, размер пор достаточен для свободного проникновения макромолекул белков.

Ковалентно сшитая стуктура полисахаридного геля позволяет путем постепенной отмывки дегидратирующими органическими растворителями получить в конечном итоге хемосорбент в сухом виде.

Схема синтеза не предусматривает использования сильно токсичных веществ, проста и легко воспроизводима. Внесение точно рассчитанного количества тиолирующего агента (ДТТ) позволяет при необходимости варьировать емкость хемосорбента по функI циональным группировкам.

Хемосорбент хорошо регенерируется и может быть использован повторно.

Кроме целей изучения белок-белкового взаимодействия полученный хемосорбент также может быть использован для выделения и очистки белков по схеме хемоспецифической хроматогра. фии.