Способ определения количества одноцепочечных разрывов в геноме клеток

Способ определения количества одноцепочечных разрывов в геноме клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСИИХ

РЕСПУБЛИК

З5„ с 12N1Ë6

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

- -" :ЕС?%9ИАУ

f. c

;i

Л (%1) 2900112/30-1» (22) 26;03.80 (Йб) 15.07.83. Ьол. И 26 (72) С.Д.:Иванов и С.Ф. Савельев (71) Всесоюзный научно-исследователь ский институт особо чистых биопрепара тов (53) 575.113(088.8) (56)1.Asada S. and oth. Appi envi †:

ronment. ИiсгоЬiol 1979, 37, 266, 2.Eastman А.and oth.,Chem.-biol. .interaact1on, 1978, 23, 369.

3.Erixon К.and oth.,Nutation res..

1979, 59, 257..,Я0„„1 28716 A (54) (57) СПОСОЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ РАЗРЫВОВ 8 ГЕНОИЕ

КЛЕТОК, включающий лизис клеток, рас-кручивание ДНК раствором едкого натра обработку ДНК ультразвуком, хроматографию полученного продукта на гидроксилапатите, индикацию количества ДНК во фракциях и расчет количества. разрывов в геноме, о т л и ч а ю ц и и " с я тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, раскручивание ДНК проводят в течение

10-?О мин, после обработки ультразвуком дополнительно проводят окрашива ние ДНК этидийбромидом, а индикацию количества ДНК во фракциях проводят Q с помощью флуориметрии.

1 1028

Изобретение относится к биологии, а именно к области репарации дезокси. риЬонуклеиновых кислот.

Для определения потенциально воз- можных мутаций в организме большое значение имеет анализ целостности re. нома, в частности определение в ДНК клеток количества одноцепочечных разрывов, образовавшихся в результате действия различных внешних Факто- 10 ров.

Известен способ определения од" ноцепочечных разрывов в геноме клеток, включающий седиментационный анализ ( в щелочном градиенте сахароэы, щелочное элюирование ДНК с миллипоровых фильтров и т.д. Г1j и (2).

Недостатком данного способа являются неприменимость для анализа ДНК с неЬольиим количеством повреждений, низкая чувствительность.

Наиболее близким к предлагаемому является спосоЬ определения числа одноцепочечных разрывов в геноме клеток эукариот с помощью щелочного рас- 25 кручивания ДНК и последующей хроматографии на гидроксилапатите. Соглас" но способу клетки млекопитающих лизируют в течение 30 мин в растворе

0,03 í 1аОН, при этом раскручивается в местах разрывов ДНК,,которую затем обрабатывают ультразвуком, и пробы подвергают хроматографии на колонках с гидроксилапатитом при, +60 С, причем ДНК элюируется 0,13 и О,?5 И К-Фосфатными буферами. Коли"

35 чество,jtHK в пробах рассчитывается с. помощью радиоактивной метки. Исходя из полученных результатов определяется фактор двуцепочечности и количество повреждений в ДНК(3).

Недостатком этого метода является непригодность для определения количества разрывов в ДНК .клеток микроорганизмов, имеющих значительно меньшую молекулярную массу генома, чем клет"

45 ки млекопитающих (10 д по сравне" нию с 10 д, соответственно).

42.

Цель изобретения - повышение точ" ности и чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения ко. личества одноцепочечных разрывов в геноме клеток, включающем лизис клеток, раскручивание ДНК раствором едкого натра, обработку ДНК ультразвуком, хроматографию полученного продукта на гидроксилапатите, индикацию количества ДНК. во фракциях q расчет коли-, 716 чества разрывов в геноме,.раскручива-, ние ДНК проводят в течение 10-20 мин, после обработки ультразвуком дополнительно проводят окрашивание ДНК этидийЬромидом, а индикацию количества ДНК во фракциях проводят с помощью флуориметрии. . Пример 1. Фактор двуцепочечности ДНК вычисляют по формуле:

CA@

pL>, 0U, где С - концентрация двуцепочечной

ДНК во Фракции мкг/мл;

С. — одноцепочечной ДНК во фрак оц ции мкг/мл.

После стрессовых воздействий на клетки количество одноцепочечных раз. рывов (и ) на единицу ДНК, раскручиваемую щелочью, определяют как (3 ) по формуле: @х и= — -Т, 8q, фр где Ф - фактор двуцепочечности ДНК клеток опытной культуры; ф - контрольной культуры.

Определяют величины факторов дву- . цепочечности штаммов микроорганизмов F.. Coll u Serr ° marcescens. Клетки микробов подвергают обработке по методике описанной выше. Полученные результаты приведены в табл. l, где показаны результаты определения чис- . па разрывов в геноме клеток.

J1 р и м e p . 2. Для оценки величины повреждающего воздействия на микроорганизмы центрифугирования проводят опыты по определению числа одно" цепочечных разрывов ДНК клеток Е.Со11 „ подвергнутых следующим перегрузкам

1500ф 60 мин, при 0-4 С. Кроме того, измеряют репарацию разрывов при после-. дующей инкубации отцентрифугираванных клеток в растворе 0,111 И NaCi npu

125 С. С этой целью образцы культуры клеток E. Coli обрабатывают по методике, приведенной выше, сразу после центрифугирования и через 30 и 60 мин после инкубации. Результаты опытов приведены в табл. 2.

Пример 3, Проводят опыты по определению фактора двуцепочечности и числа одноцепочечных разрывов в ДНК клеток Е. Со11 по методике (3 /.

Полученные результаты приведены в табл. 3.

3 1 028716 Ц

Зри определении числа одноцепочеч- количества одноцепочечных разрывов у ных разрывов получают выражение -микроорганизмов. е>о Предлагаемый способ позволяет с не ннеодее достаточной точностьп определить коВ рознит -ада г I. личество одноцепочечных разрывов в гесмысла, что свидетельствует о непри-,номе микроорганизмов после стрессовых менимости метода (3) для определения воздействий. ь

Таблица 1

Примеры Иикроорганизм

С, мкг/мл оц

С., мкг/мл

0,477

0,770

0,702

Е. С011

0,688

0 505

0,702

0,820

Ор533

0,937

0,565

О 5"7

0,938

0,493

2,165

2,985

Serr. marcesceris 0,316

1,278

2,443

О, 542

0,587

9,532

0,094

6,949

0,723

В ФВ

0,722

2,230

1,230

0,708

0,198

0,182

:0,058 0,133

102S716

I! Сф">

1 I ((! . б

I !

l (0

r

I t

О о I!

С (! (D 1

=3 !

X I I !

l (O t

Ф 3

1- ) 1

1) Ф

I х

У(X

X ((3 о!

> е.!!. а

1

) 1 3

) ((О (((1 у

l,(1

1..

I

I ,1

jl

1 ,!

I !

C(0О

-=1 О

LA

00 О

Ю м

«Ф

° Ь

О1

LA

- Ф

° Ъ

l

1 3

< о м

3 «

0О

3««

О 1

О1 л

CO

СО 4 сч . м

Ф CV б

I Ã l

1 1 ! 3 !

I ! е

1 I

I

I I (О

1! D

II ! . .!

1

1

I

1

I М

1

I

1

МЭ

Ю

t ai

C(Ю

LA м и

« .л

Ю Ю О

С4

LA л

СО СО

Ф Ю со

° с °

СЧ Ю О

СЧ

-з.

Ф

С4 м л

t I I .

1 О l

Ю LfII м сГ\

° — СО л

С4

r»

ОЪ О М

Ф л

CV СМ ( (Q

1 (11 х

Ф

С

I. l

I I (Б

I 1

-Ф

М) ° !

С >

Ю!

« м

Ю л

LA

Я„"> м

° Ъ

C( м О1

° 4

° 4м

° \ ° !

Ю Ю

1V

Ю СЧ

lA т»

ФЬ °

Ю Ю

СО Ф

К

0О

LA cu

CV О1

0О

Ю Ю м сл

СО СО

° 4 О л

I

I

l

I

I !

t ! !

I

I

I

1 !

О.

0ь ( л

М

К ((3

X ( о а

IХ о

СЧ

С ) ?

LA . О л л

Ю с (м

С)Ъ

1 (СЪ

Ю ° Ь

Ю Ю м О

r«

Ю 1

I 1

1 1

;=(. 1 о о ! !

tA л

Ю

М О сО

00 СЧ

« л

C Ю

Щ

Ю О л

Ю.

СЧ

3« л

Ю

I I

0О О ас

00 «ф л Ю

Ю Ю сО

Ф О

СС\

° л

С: (!.

1

1

1,л а

Ф

X

1( о с.

1 ! a Il 1

1 ! X l «1 3

1 е. сас(i(!

3 3

1 1 ! ! I

l I 3

I =3 о

1 1 О

I 1 1

l !

I l

3 1 .1 1

1 I х

1 6 1

-4 1

Ю а

I (7l I

CV I

lA I л !

Ю 1

СМ 1

0О 1

Ю I в

СЧ l! (1

t.I

f сО. I

М I

Ю !

СЧ t

° . t

EA I л I

Ю I

C((м 1

СЧ 1 а

СЧ 1

1

I!!

СЧ !

СМ I а 1 е»

) I

I!

I

I

I:

3 !!

I

I

f

1 .

3 !

1

I

I ф

В 1

X !

Cf I

D1 1

CL !

1028716

Таблица 3

С, мкг/мл

А

C, мкг/мл

ОЦ

Примеры Иикроорганизм

Опыты

Контрольная культура

Е. CO1) 0,249

0 503

0 331

После центрифугирования 0 .

К. Со11

1,861

1,610

Составитель А. Иакаров

Редактор Н. Воловик Техрев М.Тепер Корректор 0- Билак

Заказ 4895/24 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам -иэобретений и открытий

113035 Иосква Ж-Я Раушская наб., . 8 4/

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4