Способ разделения биополимеров

Способ разделения биополимеров

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ . БИОПОЛИМЕРОВ, предусматривающий контактирование разделяемой смеси биополимеров с полиакриламидным гелем и элюцию низкомолекулярной фракции биополимеров , отлича ющийся тем, что, с целью повышения полноты разделения и степени концентрирования фракций , разделяемую смесь биополимеров прецваригельно вводят в контакт со смесью исходных акриламидных сомономеров, инициаторов полимеризации и органического растворителя и осуществляют полимеризацию геля в присутствии биополимеров , полученный гель отделяют от реакционной среды и элюируют низкомопекулярную фракцию. 2.Способ по п. 1, отличающий с я тем, что, с целью сохранения нативности биополимеров, в качестве органического растворителя при синтезе геля используют н-гептан. 3.Способ по пп. 1и2,отличающийся тем, что в качестве смеси биополимеров используют фильтрат культуры Vibrio 569 В, содержащий холероген и О холерный антиген и для полимеризации используют смесь, соде{ жащую акриламидные сомономеры в количестве 7,5% при концентрации поперечноi сшивающего сомономера 25%. (Л 4.Способ по пп. 1 и2, отличающийся тем, что в качестве смеси биополимеров используют препарат аллергена-кокцидиоидина из Coccidioides immitis и для полимеризации используют смесь, содержащую акриламидные сЬмономеры в количестве 15% при концентрации поперечносщивающего сомономера 25%. 00 5.Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч аел ел ющийся тем, что в качестве смеси биополимеров используют культуральный фильтрат PseucJomonoiS peeudomotCeei и 00 для полимеризации используют смесь, содержащую акриламидные сомономеры в количестве 10% при концентрации поперечносщивающего сомономера 25%.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

3 (51) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3309184/28-13 (22) 22.06.81 (46) 15.08.83. Бюл. Мо. 30 (72) В. И. Ефременко, B. И. Закревский, И. M. Климова и Л. В. Ломова (71) Волгограцский научно-исслецовательский противочумный институт (53) 576.8(088.8) (56) 1. Воробьев А. А., Васильев Н. Н., Кравченко А. Г. Анатоксины. N., 1965, с. 87-84.

2, Richardson S.Н., Noftle К.А., Riг1f1cation and properties of permeabiaty factor cholera entегоtoxin

from complex and synthetic media. j. 0nf, Dis., 1970, ч. 121, Suppl., р 73-79.

3. Авторское свицетельство СССР

_#_e 663405, кл. А 61 К 39/35, 1979. (54) (57) 1. СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ БИОПОЛИИЕРОВ, прецусматриваюший контактирование разделяемой смеси биополимеров с полиакриламидным гелем и

sJIloIlHIo низкомолекулярной фракции биополимеров, отлича юшийся тем, что, с целью повышения полноты разцеления и степени концентрирования фракций, разделяемую смесь биополимеров предварительно ввоцят в контакт со смесью исходных акриламицных сомономеров, инициаторов полимеризации и органического растворителя и осушествляют полимериэацию геля в присутствии биополи„,ЯЦ„„1О35518 меров, полученный гель отделяют от реакционной среды и элюируют ниэкомолекулярную фракцию.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юш и и с я тем, что, с целью сохранения нативности биополимеров, в качестве органического растворителя при синтезе геля используют н-гептан.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч аю ш и и с я тем, что в качестве смеси биополимеров используют фильтрат культуры Ч1Ьгio СЬоРегае 569 В, соцержаший холероген и "0" холерный антиген и цля полимеризации используют смесь, содер жашую акриламицные сомономеры в количестве 7,5% при концентрации поперечно- с-

Щ сшивающего сомономера 25%.

4. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч аю ш и и с я тем, что в качестве смеси биополимеров используют препарат аллер- С гена кокцициоицина из C0ccid> О1605 irnftlit15 и для полимеризации используют смесь, содержашую акриламицные сомономеры Ме в количестве 15% при концентрации поперечносшиваюшего сомономера 25%.

5.Способпопп. 1 и2, отлича ю ш и и с я тем, что в качестве смеси биополимеров используют культуральный фильтрат Pseuclornonas pgeudomaHei u для полимеризации используют смесь, 00 соцержашую акриламицные сомономеры в количестве 10% при концентрации

° поперечносшиваюшего сомономера 25%.

1035518

Ф

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к биохимическим методам исследования, и может быть иопользовано при разделении низкомолекулярных ивысокомолекуляряих иммуноло гически активных вешеств.

Известны способы разделения соединений различной молекулярной массы путем диализа через материалы с опре. деленным диаметром пор: целлофан, кол- 10 лодиевая пленка $1) .

Однако этот способ продолжителен по времени и требует подбора материала- с опрецеленным размером пор в каждом конкретном случае. 35

Наиболее близким к предлагаемому является способ разделения биополиме ров (например, холерогена) путем гельфильтрации через биогель P-150 (полиакриламидный гель), включаюший нанесение разделяемой смеси на колонку с гелем и элюцию фракций. Для этого сухой порошок геля (биогель, акрилекс, ультрагель и др.) заливают буферным раствором и оставляют набухать. Через сутки набухший гель промывают пять раз буфером. Предварительно смонтированную колонку. заполняют гелем и промывают буфером в течение 12 ч. Исходный материал наносят на столбик геля и разделе ние биополимеров проводят при постоянной, скорости потока элюируюшего раствора и регистрации содержания биополимеров s элюате, который собирают с помошью кол лекторе отдельными фракциями одинакового обьема. Франции, содержашие один и тот жв

l35 биополимер, объединяют и концентрируют. Весь процесс разделения занима-. ет 48-50 ч P2) .

Недостатки способа - неполное раэде40 ление из-эа огранйченного по размерам пор набора выпускаемых гелей и значительное разведение материала в процессе гель-фильтрации, что требует последую щего концентрирования. Кроме того, 45 . воспроизводимые результаты разделения биополимеров методом гель-фильтрации могут быть получены лишь при наличии специального автоматизированного оборудования и высококвалифицированного персонала. Метод гель-фильтрации тре50 бует значительного времени на подготов-

«у геля, приготовление колонки, нанесение образца, проведение элюции, сбор фракций и их анализа.

11ель изобретения - повышение полно. TbI разделения биополимеров и степени концентрирования фракций, а также сох ранение нативности биополимеров.

Указанная цель, достигается тем, что согласно способу разделения биополимеров, предусматриваюшему контактирование разделяемой смеси биополимеров с полиакриламидным гелем и элюцию низко молекулярной фракции биополимеров, разделяемую смесь биополимеров предварительно вводят в контакт со смесью исходных акриламидных сомономеров, инициаторов полимеризации и органического растворителя и осушествляют полимеризацию геля в присутствии биополимеров, полученный гель отделяют от реакционной среды и элюируют ниэкомолекулярную фракцию.

При этом с целью сохранения нативности биополимеров в качестве органичеокого растворителя при синтезе геля" иопользуют н»гептан.

В качестве смеси биополимеров обычно используют фильтрат культуры Vi briо

choEerae 569 В, содержаший холероген и 0" холерный антиген и для полимеризации используют смесь, содержашую акриламидные сомономеры в количестве 7,5% при концентрации поперечносшиваюшего сомономера 25%.

В качестве смеси биополимеров используют также препарат аллергенакокцидиоидина иэ Coccidioi de s irnmitis и для полимеризаиии используют смесь, содержашую акриламидные сомономеры в количестве 15% при койцентрации поперечносшиваюшего сомономера 25%.

В качестве смеси биополимеров используют культуральный фильтрат

Pseu80wonas pseudorno_#_e< и для полимеризации используют смесь, содерФ жашую акриламидные сомономеры в количестве 10% при концентрации поперечно сшиваюшего сомономера 25%, Биополимеры (обычно белково-липополисахаридной природы с различной молекулярной массой) включают в сетчатую структуру полиакриламидных гранул, а размеры пор геля подбирают в соответствии с молекулярной массой таким образом, чтобы ниэкомолекулярные биополимеры могли элюироваться, а высокомолекулярные - оставаться внутри гранул.

Ускорение разделения биополимеров проис. ходит эа счет увеличения плошади поверхности геля, т.е. при приготовлении сферических частиц полиакриламидного геля размером 100 150 мкм. Улучшение разделения достигается включением разделяемого материала эа счет приготовления геля с заданным размером пор, что позволяет включать до 95+3% иоз 10355 хоцного материала, Процесс разделения занимает 8-10 ч. Для приготовления гранул геля, оцнороцных по размерам, процесс полимеризации провоцят при по слецовательном ввецении инициаторов: сначала персульфата аммония, затем N, N, g, N -тетраметилэтиленциамина. Сохранению нативности биополимеров в процессе приготовления гранул геля спо-собствует применение в качестве орга- 10 нической срецы H-гептана.

В результате разцеления ниэкомолекулярные биополимеры нахоцятся в элюате, а высокомолекулярные биополимеры нахоцятся в гранулах, которые в дальней-1 шем. используются в. качестве иммуносор.бентов цля ацсорбции- иммунных сывороток;

Пример 1. Разделение холерогена и "О» антигена Vibrio сЬоРегае.

В 9 мл раствора холерогена-с:ырца (фильтрат бульонной культуры V. с 1оРе "с э 569 B с соцержанием белка до 2 мгlмл) растворяют навески сомономеров: акриламица 1,5 r и N, М »метилепбисакриламица 0,5 r. Общая концентрация геля 7,5%, концентрация поперечносшивающего сомономера по отношению к обшей 25%. Катализатор - 100 мг персульфата аммония — растворяют от цельно в 1 мл 0,1 М фосфатного буфе30 ра рН 7,2 с 0,15 М хлористым натрием.

Оба раствора цегаэируют в вакууме 10 мин.

В 100 мл H -гептана растворяют 0,25мл эмульгатора СПЭН=85, смесь переносят в сосуц цля полимеризации и процувают газообразным азотом 5 мин.

Эмульгирование воцной фазы в органи« ческой и послецуюшую полимеризацию осуществляют в колбе при перемешивании на электрической мешалке (300500 об/мин) в атмосфере азота. Вначале

40 в течение 1 мин перемешивают органическую фазу с эмульгатором, затем смешивают цегазированные вацные растворы сомономеров и катализатора и, не

45 прекращая перемешивания органической фазы, мецленно выливают воцную фазу в сосуд цля полимеризации. После цву: минутного перемешивания к образовавшейся эмульсии воцы в масле" добав,ляют 100 мкл N, N, N, p тетраметилэтиленциамина (ТЭМЭД}. Полимеризация происхоцит в течение 15-20 мин, об ее завершении суцят по резкому помутнению эмульсии и обнаружению при световой микроскопии желтоватьи сферических

° частиц диаметром 150-200 мкм. Образовавшуюся взвесь гранул отцеляют от органической фазы, холероген элюируют

18 4 буфером в течение суток при перемешива4 нии. Холероген характеризуют по соцержанию белка и углевоцов, а также по биологической и серологической активности.

В табл. 1 прецставлена характеристика холе рогена исхоцного фильтрата, полу ченного по прецлагаемому способу и прототипу.

Как слецует из табл. 1, прецлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет разцелить холероген (М M 84000 а.е.) и "0" антиген (М М 100000-300ОООа.е,) что поцтвержцено результатами реакций непрямой гемагглютинации C "0 -холерной агглютинируюшей сывороткой и преципитации в геле.

Пример 2 . Раэцеление аллергена и высокомолекулярного полисахарица воэбуцителя кокцициоицоэа.

Аллерген - кокцициоицин (25 мг препарата антигена), полученный из Cocciд1о1des irnm1 s 36-Сильвейра известным способом I..3), растворяют в 5 мл буфера и готовят ПААГ-гранулы по вышеописанной метоцике. Концентрации геля составляет: общая 15%, поперечносшиваю ° щего сомономера 25%. Аллерген характе ризуют по соцержанию белка и углевоцов, а также по биологической и иммунохимической активности.

В табл. 2 цана характеристика аллергена-кокцидиоицина исхоцного, полученного прецлагаемым способом и прототипу е

Как слецует иэ табл. 2, прецлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет разцелить аллерген (N М 1200020000 а.е.) и высокомолекулярный полисахариц (N N 60000-400000 а.е.), что поцтвержцено результатами реакции иммуноциффузии в геле.

Пример 3 . Разцеление токсина и термостабильного гликопротеицного антигена возбуцителя мелиоицоза.

В ПААГ гранулы включают культураль ный фильтрат Peevdomanas psevdoni Mei (1,2 мг белка в мл). Концентрация геля составляет: общая 10%, поперечносшиваюшего сомономера 25%. Раэцеление токсина провоцят по описанной выше метоцике. Токсин характеризуют по соцержанию белка и углевоцов, а также по биологи« ческой и иммунохимической активности.

В табл. 3 цана характеристика термолабильного мелиоицоэного токсина исхоцного, полученного по прецлагаемому .способу и прототипу.

Реакция непрямой гемагглютинации с «0" холерным анти

Количество линий в реакции имму« нодиффузии в геле

Белок, мг/мл

Углеводы, мг/мл

Материал по способу

Объем мл

"О "холерной антитоксической тельным циагностикумом

Исхоцный фильтрат

М. сЪо0е -сне: 5

1:1024

0,9

1,25

1;256

П ре длагаемый алюат

0,86

0,1

1:512 нет

Извес тный элюат после гель-фильтрации

40 1:64

0,18

0,1

1*4

Таблица 2

Количество линий

Активность в кожной пробе (размер эритемы, мм) Материал о Обьем способу мл

Углевоцы, Белок, мг/мм мг/мл преципитации в реакции иммунодиффузии в геле с иммунной сывороткой

Исходный алле ргенкокцидиоидин

0,5 0,88

9,7

Предлага мый элюат

0,135 0,15

9,0

Известный элюат и ле гельфильтрации

60 2,0

0,04 007

3 10355

Как следует из табл. 3, .предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет разделить мелиоицозный токсин (M N 30000 а.е.) и термостабильный антиген (М М 750000 а.е.), что подтверкцено результатами реакции иммуно диффузии в геле.

Изобретение по сравнению с известным способом позволяет более эффективно разделять биополимеры вслецствие полного (цо 95%) включения внутрь геля.

1 исхоцного материала, возможности приготовления геля с заданными размерами

А ктивность в кожной пробе (титр) при ввецении ,1 мл пор, что обеспечивает иммобилизацию высокомолекулярных примесей и элюцию интересуюших биополимеров, провецения элюции небольшими обьемами, что сни-, жает степень разбавления полученных препаратов и позволяет отказаться от последующего концентрирования, значительного сокращения (в 4-5 раз) времени разделения биополиме ров.

Для проведения разделения биополи» меров предлагаемым способом не требуется сложной аппаратуры и высококвалифицированного персонала, Таблица 1

1035518

ТаблидаЗ

Исхоцный фин ьтрат

0,86 1,2

1:6

Прецлагаемый элюат

15 1:8

0,19 0,4

Известный элюат после гель-фильтрации

60 1:1

0,08 0,13

Заказ 5824/45 Тираж 873 Поцписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по целам изобретений и открытий. 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель О. Скородумова

Редактор В. Ковтун Техрец Т.Фанта Корректор А. Ноах