Способ получения антибиотического комплекса
Патент 1039446
Авторы
Способ получения антибиотического комплекса
Иллюстрации
Реферат
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА общей формулы 4tfH . (НГ pjК--ЙоОКэ где , R2.-(-CH2-CH -), антибиотик PS-6; R(-H, R2-() , R.-H - антибиотик PS-7, отличающийся тем, что штамм Streptomyces А 271.выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях при 20-37 с и рН 5-9 с последующим выделением целевого продукта в виде. комплекса и разделением его на антибиотики PS-6 и PS-7 и/или переводом их в соли, и/или переводом антибиотиков PS-6 и PS-7 и/или их солей в соединение, где низший алкил или группа трифенилметила. 2. Способ -по п. 1, о т л и ч а ю . щ и и с я тем, что, с целью поI вышения выхода антибиотика PS-6, в питательную среду в, процессе кульОТ тивирования вводят валив и/или лейцин , или Н-валериановую кислоту.Приоритетпо признакам: 113.10.77 получение антибиотика PS-6; 29.12.77 получение антибиотика PS-7.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
П9) (ii) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
@ pg ô® @ g g
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2673547/28- )3 (22) 12.10.78 (31) 121857/77, 160424/77 (32) 13.10.77 29.12.77 (33) Япония (46) 30.08.83. Бюл. Р 32 (72) Казухико Окамура, Содзи Хирата, Ясуси Окумура, Ясуо Фукагава, Ясутака Симаути, Томоюкн Исикура, Кагеаки
Коуно (Япония) и Джозеф Лейн (США) (71) Санраку-Оушн Ко, Лтд. (Япония) (53) 615.779.931 (088.8) (54)(57) 1. спОсОБ пОлучениЯ АнтиБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА общей формулы
6 г "0
0Н 0 0003з ! где R(-СН, Rg-(-СН2-СИ -) КЗ-Н антибиотик PS-6;
R(-Hi, Rg — (CH=CH-), К -Н - антибиотик PS-7, 5(51) С 12 Р 1/06 //(С 12 Р 1/06;
C 12 R 465) отличающийся тем, что штамм Streptomyces А 271 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях при
20-370С и рн 5-9 с последующим выделением целевого продукта в виде. комплекса и разделением его .на антибиотики PS-6 и PS-7 и/или переводом их в соли, и/или переводом антибиотиков PS-6 и PS-7 и/или их солей в соединение, где В - низший алкил или группа трифенилметила.
2. Способ .по п. 1, о т л и ч а ю.шийся тем, что, с целью повышения выхода антибиотика PS-6, в Q питательную среду в процессе культивирования вводят валин и/или лейцин, или Н -валериановую кислоту;
Приоритет по признакам:
13.10.77 получение антибиотика PS-6;
29.12.77 получение антибиотика PS-7. Я
1039446
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотиков.
Цель изобретения — получение антибиотического комплекса общей формулы
I где R<-СН, Rg-(-СНу-CH2 ) Rq Н антибиотик Р$-б;, R)-Н, Rg-(-СН=СН-), Rg-Н - анти. биотик PS -7.
Указанная цель достигается.тем, что согласно способу получения антибиотического комплекса штамм
Streptomyces A 271 выращивают в питательной среде, содержащей источ ники углерода, азота и минеральные .соли, в азробных условиях при 2037оС и рН 5-9 с последующим выделением целевого продукта в виде комплекса и разделением его на антибиотики PS-6 и PS-7 и/или переводом их в соли, и/или переводом антибиоти ков PS-б и PS-7 и/или их солей в соединение, где Rq- низший алкил или группа трифенилметила.
20
30
Для повышения выхода антибиотика PS-б в питательную среду в про цессе культивирования вводят валин и/или лейцин, или Н-валериановую кислоту.
Штамм Streptomyces А 271 для получения антибиотического комплекса выделен иэ образца почвы вблизи
Эйгеджи Темпль в Иошида Дистрикт в префектуре Фукуи, Япония. 40
Штамм Streptomyces А 271 депонирован под индексом ГЕРМ-P Р 3984 в
Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science
and Tecnnology of Japan, а также 45 под номером АТСС 9 31538 в American
Туре Culture Collection.
Морфологические признаки. Разветвленный спорулированный аэральный мицелий, головки аэрального мицелия представляют собой крючки, петли или неполные спирали. Овальные или цилиндрические споры образуют депь из более чем 10,обычно
10-50 спор. Размер 0,8 ° 1,0 ° 1,01,8 мкм, поверхность гладкая. Не наблюдается ни жгутиков, ни споронгия. На аэральном мицелии образуют-. ся гифы.
Культуральные признаки. Сахарозо-нитратная агаровая среда. Рост 60 обильный, цвет воздушного мицелия ярко-оранжево-желть1й. Субстратный мицелий ярко-желтый до ярко-оранжево-желтого. Растворимый пигмент отсутствует. 65
Глюкоэо-аспарамновая агаровая среда. Рост обильный. Воздушный мицелий светло-оранжево-желтый до ярко-оранжево-желтого. Субстратный мицелий ярко-желтый. Растворимый пигмент отсутствует.
Глицерин-аспарагиновая агаровая среда. Рост обильный. Воздушный мицелий светло-оранжево-желтый до ярко-оранжево-желтого, субстратный мицелий бледно-желтый, немного желтовато-гвоздичного цвета. Растворимого пигмента нет.
Агаровая среда с крахмалом. Рост обильный. Воздушный мицелий светлооранжево-желтый до ярко-оранжевожелтого. Субстратный .мицелий ярко-. оранжево-желтый до ярко-желтого.
Растворимый пигмент отсутствует.
Питательная агаровая среда. Рост обильный. Воздушный мицелий твердо сформированный, если образуется, несколько темный. Субстратный мице-лий светло-желтый. Растворимого пигмента .нет.
1 а
Агаровая среда с дрожжевым аоло-" довым экстрактом. Рост обильный.
Воздушный мицелий светло-оранжевожелтый до ярко-оранжево-желтого.
Субстратный мицелий ярко-оранжевожелтый до светло-коричневого. Растворимый пигмент отсутствует.
Агаровая среда с овсяной мукой.
Рост обильный. Воздушный мицелий светло-оранжевый до ярко-оранжевожелтого. Субстратный-мицелий яркожелтый. Растворимый пигмент отсутствует.
Физиологические признаки. Растет при 10-40 С, оптимум роста 20-30ОС.
Желатин сжижает., Крахмал гидролизует. Молоко пептонизирует, но не коагулирует. Меланоидных пигментов не образует.
Хорошо усваивает L-арабинозу, D-ксилозу, D-глюкозу, L-рамноэу.
Слабо усваивает сахарозу. Не усваивает D-фруктозу, инозит, рафинозу, D-маннит.
Способ получения антибиотического комплекса осуществляют выращиванием штамма Streptomyces A 271 в питательной среде„ содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в аэробных условиях при
20-37 С.
Источниками углеводов являются глюкоза, глицерин, мальтоэа, сахароза, меласса, декстрин и крахмал, масла и жиры, такие как соевое масло, ореховое масло или лярд.
Источниками азота могут быть пептон, солодовый экстракт, соевая мука, масло семян хлопчатника, сухие дрожжи, жидкость от эамачивания кукурузы,, дрожжевой экстракт, снятое молоко, каэеин, нитрат натрия, нитрат аммония и сульфат аммония.
1039446
В качестве неорганических солей при. . РН растворителем, например этилменяют дикамитфосфат, хлористый ацетатом или Н-бутаном, и обратная натрий, карбонат кальция и сульфат экстракция из слоя растворителя в магния. При необходимости могут . водный слой при более высоких РН, быть добавлены микроэлементы (ко- экстракция при нейтральном РН. таким балы и марганец). растворителем, как хлористый метиДля предотвращения вспенивания лен или хлороформ в присутствии во время тепловой стерилизации и липофильных солей четвертичного ферментации могут быть добавлены аммония, таких как бензалконий хлопротивовспенивающие агенты, такие рид или тетрабутиламмоний кислого как силиконовые или растительные $P сульфата или циклических соединений,. масла. таких как простой эфир дициклогекДля увеличения выхода антибио- сил-18-цикло-б, простой эфир 15-цик-. тика PS-б могут быть добавлены лс -5 и обратная экстракция из слоя аминокислоты или органические кис- :растворителя в нейтральный водный лоты к питательной среде во время 15 !слой, содержащий .иодид натрия, .культивации Streptomyces A 271. иодид калия, адсорбция на активиВ качестве аминокислоты могут быть рованном угле Амберлите ХАД, Диайон использованы нейтральные аминокисло.. HP-20 и элюирование водным раствоты, имеющие 2-.10 атомов углерода, ром метанола, водным ацетоновым в частности валин и лейцин, а в ка- раствором, адсорбция и элюирование честве аминокислоты используют али- 20 с ионообменной смолы, такой как фатические органические кислоты, Дауэкс 1х 2 или GAE-Сефадекс A-25, имеющие 2-10 атомов углерода, напри- :гель-фильтрация с Сефадексом g-10, .мер Н-валериановую кислоту. Количест- Био-Гель P-2, Био-Бидс Q-ХЗ, колоночво добавляемых аминокислот или ор- ная, или тонкослойная хроматография
l ганических кислот может быть в пре- с целлюлозой (Ависелем 5F ДЭАЭделах 0,01-1% (вес/объем1, предпочти» целлюлозой, Ватман ДЕ-32, ДЭАЕ-Сетельно 0,1-0,5g (вес/объем1. Эти фадексом А-25, силикагелем, окисью. соединения могут быть добавлены в алюминиЯ и осажДение при добавле- начале культивации или в интервале : нии такого РаствоРителЯ, как аЦетон. до 100 ч от начала культивации. Ами- З0 Для выделения антибиотика Р$-7 нокислоты или органические кисло- из антибиотического комплекса имеI ты могут быть добавлены одновремен- ющего насыщенную углеродную цепь в но или раздельно и подаваться через серной боковой цепи, в котором могут различные интервалы. быть продуцированы и получены одноС еда до культива ии может быть
Н 5-9 К тивирование осуществляют в аэробсреды ° Уле- нообменн у хроматографию йа смолах, . ных условиях ..Культивацию проводят в которой активные к.
Р ые компоненты адсорпри перемешивании и/или а бируются на анионообменной смоле или аэрации.
Температура выращивания 20-40 С, 40 Да предпочтительно 25-35 С.
Ферментацию проводят до тех пор ,или Диайон РА 306 пока не будет получено доста о количество антибиотиков PS-б и/или солью с пос оследующим элюированием анР$-7. Время ферментации обычно сос" 45 ля тибиотика PS-7 во н тавляет 30-90 ч но оно может меняться в зависимости от. состава:с еды и температуры. Количество антибиотиков PS-б и/или PS-7 в ф содержащего 0,1-10, предпочтительв феРмента- . но 1-5Ъ нео ганичес ционном бульоне может быть определено с помощью метода биологического испытания и биОаутографии, тый натрий.
Так как полученные антибиотики
PS-б и PS-7
$ 7 в продукте ферментации В зависимости от условий культиявляются водорастворимыми и главным вации в ферментационном бульоне одобразом присутствуют в микробных 5;новременно образуется антибиотик клетках, предпочтительно удалять,PS-4 или его соль. Антибиотики PS-4 клетки после процесса ферментации -.,и PS-7 продуцируются одновременно такими методами, как фильтрование, и могут быть разделены один от другоцентрифугирование или экстракция, и ro с помощью различных методик, наизвлекать антибиотики из фильтрата .60 пример, адсорбируют раствор, содернадосадочного слоя или экстракта. жащий антибиотики Р$-4 и PS-7 с not
Извлечение антибиотиков может мощью адсорбирующей смолы, такой быть осуществлено с помощью различ- как Диатон НР-20 AG, и элюируют анных известных процессов. Может быть тибиотики с градиентом 0-50%, предиспользована экстракция при низких gg,почтительно 0-,103 полярного раство1039446 рителя, растворенного в воде, такого как водный ацетоновый раствор.
Антибиотик PS-6 характеризуется следующими физико-химическими и биологическими свойствами.
Хроматография на бумаге. 5
Антибиотик PS-6 показывает следующие величины Rg при проведении нисходящей хроматографии на бумаге в следующих растворителях:
Rg
Ацетонитрил (трис/ЭД Й)
Этанол (вода
7/3) 0,41.
0,65
Тонкослойная хроматограФия (ТСХ) °
Для натриевой соли антибиотика
PS-6 при проведении тонкослойной хроматографии с использованием пластинчатых хроматограмм 13254 и следующих проявляющих раст орителей получены величины Rq
Н-Бутанол/эта. нол/вода (4/1/5) (верхний слой)
Н-Пропанол/вода (8/2)
Н-Бутанол/иЗо—
-пропанол/вода (7/7/6) 0,67
0,69
0,63
Электрофореэ на бумаге при высоком напряжении .
Когда антибиотик PS-6 (натриевую
35 соль) подвергают электрофорезу на
Тойо фильтровальной бумаги М 50, видно, что антибиотик мигрирует на расстояние по крайней мере 5 мм (обычно 10-40 мм) по направлению к аноду 40 при пропускании тока в течение
30 мин при градиенте 42 В/см в буфере (РН 8,6), содержащем 3000 мл воды, 3,3 г барбитала и 25,5 г барбитала натрия. 45
Не проявляет активности по отношению к Р -zzaKTaxaae Bacillus cereus.
Антибиотик Р$-6 является одноосновной кислотой, имеющей одну карбоксильную группу в молекуле. 50
Характерный максимум УФ-поглощения антибиотика PS-6 (натриевая соль) является следующим:h н „, 300нм.
Характерные максимумы поглощения
ИК-спектра антибиотика PS-6 (натрневая соль), измеренного по методике с таблеткой KBr, см: 1760 (-СОв лактамном цикле); 1660 (-СО-амида); 1600 (-СОО).
Молекулярная масса приблизительно 312 (вычислено из результатов; 60 масс-спектрометрии высокого разрешения для метиловогЬ сложного эфира PS-6).
Реакция с реагентом Эрлиха положительная. 65
Реакция с иодом-хлорплатиновбй кислотой положительная, нингидридная реакция отрицательная.
Антибиотик PS-6 растворим в воде при рН 6-9, но не растворим в бензоле, ацетоне и этилацетате.
Приведенные физико-химические с свойства четко показывают, что в молекуле антибиотика PS-6 (натриевой соли) имеются группы СН -CH-; и Сн
CHqCO- -С -;-С (-;-Cq, - РСОи -СОО
И С.ОО = .- О
По РезУльтатам масс-спектрометрии высокого разрешения для метилового сложного эфира получена следующая молекуляриая формула антибиотика PS-6: Сцн N О $. гог4
Антибиотик PS-6 имеет следующую . структуру: н, Н -СН 3-ОН - Н -МН— - ТОЩ)
0 1 ООН
Биологические свойства антибиотика P$-6.
Антибиотик Р$-6, обладающий широким спектром антибиотических активностей, проявляет очень высокую активность против различных бактерий, например грамположительных бактерий, принадлежащих к виду
Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus u Bacillus è грамотрицательных бактерий, принадлежащих к видам Aleaiigenes Сomamonas Антибиотик PS-6 также показывает,высокую активность, например, против грамотрицательных бактерий, принадлежащих к виду Klebsiella, Proteus.
Антибиотик PS-6 проявляет высокую активность против грамотрицательных бактерий, которые являются реэистентными к антибиотикам, имеющим Р -лактамный цикл в структуре, например, .против тех бактерий, которые принадлежат к видам Citrobacter, Proteus, К1ebsiella.
Антибиотик PS-6 обладает способностью увеличивать антибиотическую активность других антибиотиков, в особенности -лактамных антибиотиков, таких как пенициллины, цефалоспорины, против таких продуцирующих -лактамазу бактерий, как Proteus yuigaris, Serratia marcescens.
Активность in vivo.
Антибиотик проявляет высокое терапевтическое действие при введении мышам, зараженным патогенными грамположительными бактериями.
Токсичность.
Антибиотик не токсичен при интраперитонеальном введении мышам в дозе 500 мг/кг.
1039446!
Тонкослойная хроматография (ТСХ) ..
Антибиотик. PS-7 (натриевая соль)показывает следующие величины R при тонкослойной хроматографии йа хроматографической пластине 13254 из целлюлозы со следующими систе- 20 мами растворителей:
H -Бута нол/э танол/вода (4/1/5) (верхний слой)
H-Пропанол/вода (7/3) н-Бутанбл/изопропанол/вода (7/7/6)
Ацетонитрил/вода (8/2) . 25 бн3- )- Н=1Н Mi= 0 >3 у <00а
0,61
0,81
0,71
0,65
Электрофорез высокого напряжения на бумаге.
Антибиотик PS-7 (натриевая соль) при электрофорезе на Тойо фильтровальной бумаге Р 50 с использованием аппаратуры для электрофореза на бумаге при высоком напряжении 40 мигрирует к аноду по крайней мере на 5 мм . (обычно в интервале 1040 мм) в буферном растворе, содержащем 3,3 r барбитала, 25,5 г барби-,. тала натрия и 3000 мл води (рН 8,6) 45 при пропускании тока 42 В/см в течение 30 мин.
Антибиотик Р$-7 является неактив» ным к -лактамазе из Bacillus cereus.
Антибиотик PS-7 является одноос-. 50 новной кислотой, содержащей одну карбоксильную группу.
УФ-спектр поглощения антибиотика PS-7 (натриевой соли) имеет следующие характеристики (максимумы поглощения)гД "1 ъ 220 нм и к о а
-308 нм макс
ИК-спектр поглощения антибиотика PS-7 (натриевой соли),. измеренный .в таблетке с KBr, имеет харак- 60 теристические максимумы поглощения со следующими волновыми. числами, см : 1760 (-CO-р-лактамного цикла); 1670 (-CO-амида); 1 1620 (СОО"
-СН=СН-). 65
Антибиотики PS-7.
Физико-химические свойства антибиотика PS- 1.
Хроматография на бумаге.
Антибиотик PS-7 (натриевая соль) показывает следующие величины R при нисходящей хроматографии на бумаге с использованием Тойо фильтро» . вальной бумаги 9 ..50 на следующих системах растворителей:
R)
Ацетонит-,. рил/трис/ЭДТК 0,41
Этанол/вода 0,68
Молекулярная масса приблизительно .296 (вычислено из результатов масс-спектрометрии высокого разрешения для метилового эфира антибиотика PS-7).
Реакция с реактивом Эрлиха положительная.
Реакция с иод-хлорплатинатом положительная.
Реакция с нингидрином отрицательная.
Легко растворим в воде при рН 9, практически нерастворим в бензоле, ацетоне и этилацетате.
Физико-химические свойства приводят к утверждению, что антибиотик PS-7 (натриевая соль) имеет группы СН -СН -, СН СО-; -CH=CH Н- + у -NHCO- и -СОО в моО лекуле. Антибиотик PS-7 является соединением со следующей структурной формулой:
Биологические свойства антибиотика PS-7.
Антибиотик PS-7 обладает широким спектром антимикробной активности. Он показывает очень высокую антимикробную активность на различных микроорганизмах, например грамположительных бактериях, принадлежащих к виду Staphylococcus или к виду Diplococcus, а также высокую антимикробную активность по отношению к грамотрицательным бактериям, принадлежащим, например, к виду Alcaligenes.
Антибиотик PS-7 характеризуется ,своей высокой антимикробной активностью по отношению к грамотрицательным бактериям, принадлежащим, например, к виду Citrobacter или к виду Entегоbacter которые являются резистентными к известным Р -лактам-ным антибиотикам.
Антибиотик PS-7 обладает способностью увеличивать антимикробную активность других антибиотиков, например -лактамных антибиотиков, таких как цефалоспорины, по отношению к бактериям, продуцирующим
1- .
-лактамазу, таким как Proteus vulgaris или Serratia marcesoens.
Активность in vivo.
Антибиотик оказывает значительное терапевтическое действие при введении мышам, зараженным патогенными грамположительными бактериями.
Антибиотик не показывает острой токсичности при интраперито9 1039446 ,.1 0 неальном введении- мышам при дозе хлорист и Н
500 мг/кг. сты Н -пентил, бромистый Н -пентил, иодистый Н вЂ”.пентил;,::Н «ЫйсййоАнтибиотики PS-,6 и PS-7 являют- ный спирт бро и Н ирт, ромиСтЫй;Н:.-;гексйл,: ся стабильными н..солевой форме .- - иодистый Н -гек
-гексил, тритилоный спир, соленая. форма включает, напри- тритилмеркаптан ан, тритилхлорид и тример, соли щелочиых металлов, таКие 5 тилбромид, как натриевую соль, калиевую соль". Реакцию антибиотика PS 6 или: или литиевую соль,,;соли щелочно- PS-7 с соединен ф единениями формулы К3 У земельных металлов, такие как каль- или с низшим диа изшим диазоалканом можно проциеная или магниевая соль, соли дру- водить известными с ыми методами: этерифигих металлов, такие как алюминие- 10 кации без реа и ез реакционной среды, но вая, аммиачная, соли первичных, вто- обычно ее проводят одят в инертной жидкой ричных или третичных аминов, как среде. моноэтиламин, диметиламин, триэтил- Инертные жидкие жидкие среды включают, амин, моноэтаноламин или диэтилол- например такие г акие углеводороды,, как амин, и соли органических оснований, 15 бензол, толуол, Н -гексан или циклоан, галоидированные углеводоротакие как бензатин или прокаин. гексан гал
Пригодными солями являются также- ды такие как х соли щелочных металлов, такие как тый метил н ие как хлороформ или хлорис-, метилен, амиды, такие как динатриевая или калиевая соли. метилформами
Антибиотики PS — 6 и PS-7 являют- триамид дим ормамид или гексаметилфосфорориамид, диметилсульфоксид, простые ся однооснонными кислотами, имею- о эфиры та и э иры, такие как диэтиловый эфир, щими одну карбоксильную группу в мо- диизопропиловый эфир, +II -и-бутилекуле. С помощью различных спир- ловый эфир вы э ир, тетрагидрофуран или дисложные э иры, такие как тов меркаптанон нли их производ- оксан сложные ных из антибиотиков могут быть получены различные сложные эфиры. тоны такие т или — утилацетат, и кеы, такие как ацетон или метилПодходящими сложными эфирами этилкетон. антибиотиков PS-6 и PS-7 являются Температура емпература реакции может менятьте из них, которые отвечают следу- ся в широких пределах в зависимости ющей структурной формуле
1 инертной среды, однако не должна йi "H p — л -ЗН-СО-СК превышать б 0 С (предпочтительно
1:Зй
° °
Р дг 4 з 0-40 С) . При необходимости в реаки ооя ции может быть использован промоО М тор, такой как триметиламин, триэтиламин, пиридин или дициклогекгде R — низшая алкильная группа силкарбодиимид. В этих условиях или трифенилметильная группа. реакция может быть закончена за
Ь формуле низшая алкильная груп- 1-24 ч обычно за 3-12 ч. па ж быть группой с прямой или Антибиотики PS-6 или PS-7, которазветвленной цепью, в частности : 4О Рые должны быть ннедены в Реакцию, группой, имеющей 6 или менее ато- необязательно выделять в виде самомов углерода или группой, .имеюго продукта. Можно также использощей 1-4 атома углерода. Примерами вать и сырой антибиотик PS-6 или является метил, этил, н -пропил,, PS-7, полученный путем частичной изопропил, Н -бутил, 5 lO -бутил, очистки продукта культивации. ПриН-пентил, Qçî -пентил и H ãåêñèë. 45 мером таких частично очищенных проСложные эфиры приведенной фор- дуктов является концентрированный мулы могут быть получены при взаиэлюат из активиронанного угля и модействии антибиотика р5-6 или концентриронанный элюат иэ Диайон р5-7 или нх солей с соединениями об НР-20, котоРыми обРабатывают отщей формулы фильтрованный бульон, обессоленный концентрат элюата с активированного
К У, угля, полученного с градиентом конг е V — а центрации хлористого натрия в фосгде — атом или группа, которая фатном буфере из CAE-Ce адекс на может быть отщеплена, котором адсорбирован концентрированили с низшими диазоалканами. . ный элюат из Диайон HP-20 концент/ риронанный метиленхлоридный экстПредставителями соединения этой ракт в присутствии бензалконийхлоформулы являются метилов тся метиловый спирт, рида, хлороформный концентрированный иодистый метил име д тилсульфонат, экстракт и бутанольный концентрирометилмеркайтан, хлористый Н -пропил, 6О ванный экстракт при рН 3,5 при низ-, иодистый Н -пропил, пропилоный спирт кой температуре.
ИЗо-пропиловый спирг б омистый р, р мистый Полученные таким образом антибиоизопропил, иодистый изопроил, Н -бу- тики PS-6 или PS-7 r тиловый спи т б ки — или — могут быть выиодистый Н -б тил - е рт, ромистый Н -бутил, делены из реакционной с
1 смеси или очи- утил, Н -пентиловый спирт„ 65 щены известными способами. После 1039446
0,51
0,37 завершения реакции. реакционную смесь спектром и проявляет высокую активсначала выливают в водную среду для ность против различных бактерий, удаления водорастворимых примесей, например грамположительных бактетаких .как побочные продукты. Пред рий, принадлежащих к виду Staphyloпочтительно используют нейтральный . coccus, Diplococcus Streptococcus, уф р в качестве водной среды для и грамотрицательных бактерий., при5 сохранения нейтрального рН. Слож- надлежащий к виду Alcaligenes. ный эфир антибиотика PS-б или Р$-7 Тритиловый эфир антибиотика PS-6 в этой смеси.экстрагируют затем . также проявляет хорошую активность менее полярным органическим раст- против грамотрицательных бактерий, ворителем, который по существу не 10 принадлежащих к виду Klebsielia, смешивается с водой, таким как этил- Proteus. ацетат, бензол или хлороформ. Мож- Тритиловый эфир антибиотика PS-6 но добавлять хлористый натрий или . проявляет высокую активность против сульфат аммония. грамотрицательных бактерий, которые
После сушки над безводным сульфа- 5 являются резистентными к антибиотитом натрия сложный эфир выделяют - кам, имеющим в своей структуре )— из слоя растворителя известными . лактамный цикл, например, против способами, например гель-фильтраци- бактерий видов Citrobacter Proteus ей, используя Био-Биидс S-Xs или Klebsiella u Serratia.
Сефадекс LH-.20, или адсорбционной Активность in vivo. х оматог а р тографиеи, используя такой но-, Тритиловый эфир антибиотика Р$-6
20 ситель, как силикагель, окись алю- проявляет терапевтический эффект миния или фло оси при введении мышам, зараженным грамОчищенный таким образом сложный положительными патогенными бактеэфир очищают перекристаллизацией риями. из такого растворителя, как бен- 25 Токсичность. зол, толуол, ксилол, этилацетат, .Тритиловый эфир не токсичен при диэтиловый эфир, хлористый метилен, интраперитонеальном введении мышам хлороформ, гексан и петролейный . в дозе 500 мг/кг. эфир. Тритиловый эфир антибиотика PS-7.
Среди сложных эфиров тритиловый 30 Физико-химические свойства тритиэфир антибиотика PS-б или PS-7 яв- лового эфира антибиотика Р$-7. ляется более стабильным, чем анти- уф-спектр поглощения Я си Н = биотик PS-б или PS-7, и обладает . = 321 0 нм и = 230 5
1 нм более высокой антибактериальной ак- Цветные реакции. тивностью и активностью по ингиби- 35 Реакция с реагентом Эрлиха полорованию Р -лактамазы. жительная.
Физико-химические и биологичес- Реакция с иодом-хлорплатиновой кие свойства тритилового эфира ан- кислотой положительная. тибиотиков Р$-б и Р
Р$ б и Р$-7. Нингидринная реакция отрицательФизико-химические свойства трити 40 ная. лового эфира антибиотика Р$-,6. Тонкослойная хроматография (ТСХ).
315 0 нм.
УФ-спектр поглощения с ">о макс дС-Фертигплаттен Кизельгел 60 Р ь
Цветные реакции.
Реакция с реагентом Эрлиха положительная.
45 {2/1)
Реакция с иодом-хлорплатиновой
Бензол-этилкислотой положительная. аце тат (1/8) 0,67
Реакция с нингидрином отрицательная .
Биологические свойства тритиловоТонкослойная хроматография (ТСХ) . 50
Получены следующие величины Rg
Антимикробный спектр. на пластинах со следующими раствоТритиловый эфир антибиотика Р$-7 рителя при ТСХ сложного эфира: обладает шиРоким антимикРобным спект дС-Фертигплаттен Кизельгель 60 Р ром и проявляет очень высокую активR
ЗФ. ность по отношению к различным бак1 териям, например грамположительным, Бензол/а етон (/ )
2 1
/ ц о бактериям„ принадлежащим к видам
Staphylococcus, Diplococcus u StrepБензол/этил- tococcus и грамотрицательным бакацетат (1/8) 0,34 териям, принадлежащим к виду Alcali60 genes
Биологические свойства тритилово- - Тритиловый эфир антибиотика Р$-7 также показывает хорошую активность
Антимик обный. спект против, например, грамотрицательТритиловый эфир антибиотика PS-6 ных бактерий, принадлежащих к видам обладает широким антибимикробным 65 Klebsiella u Proteus.
1039446
Тритилоный эфир антибиотика PS-7 проявляет высокую активность против грамотрицательных бактерий, которые являются резистентными по отношению к антибиотикам, имеющим
Я-лактамный цикл в своей структуре, например, по отношению к СяtrоЬасtег
Proteus, Klebsiella H Serratia.
Активность in vivo.
Тритиловый эфир антибиотика PS-7 проянляет высокое терапевтическое действие при введении мышам, зараженным патогенными грамположительными бактериями.
Токсичность.
Тритиловый эфир не проявляет острой токсичности при интраперитонеальном введении мышам н дозе
500 мг/кг.
Тритиловые эфиры антибиотиков
PS-б и PS-7 и сами антибиотики проявляют высокие антимикробные активности и могут быть эффективно использованы для профилактики и терапии бактериальных инфекций, встречающихся не только у людей, но также и у животных, например млекопитающих, у домашней птицы и рыб.
Кроме того, тритиловый эфир является очень важным в качестве промежуточного продукта для синтеза других фармацевтических препаратов, потому что тритиловая группа в тритиловом эфире является очень активной и легко отщепляется.
Антибиотики PS †и PS — 7 или их тритиловые эфиры могут быть введены орально, местно или парентерально (внутривенно, внутримышечно, интраперитонеально и т.п.) и могут быть использованы в одном иэ обычных фармацевтических препаратов в зависимости от пути введения. Например, антибиотик PS-б или его тритиловый эфир может быть приготовлен с фармацевтически приемлемым носителем или раэбавителем в твердых формах (например, н виде таблеток, капсул, порошков, гранул, таблеток, покрытых сахаром, порошков для распыливания, свечей), полутвердых формах (например, мази, кремы, полутвердые капсулы) или жидких формах (например, жидкие растворы, эмульсии, суспензии, лосьоны, сиропы, растноры для инъекций, жидкие составы для распыления).
Единица дозы препарата, содержащего антибиотик PS-б или его тритилоный эфир, может содержать 0,199 вес, Ъ, (предпочтительно 10-60) активного компонента в любой форме: жидкой, полутвердой или твердой.
Таблетки и капсулы для орального введения могут быть в виде препаративной единицы дозы и могут содержать связующие агенты, например сироп, камедь, желатин, сорбит, трагекант или полининилпирролидон; наполнители, такие как лактоза, сахароза, крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицин, смазки, такие как стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль, или окись кремния, дезинтеграторы, например картофельный крахмал или смачивающие агенты1 такие как натрийлаурилсульфа.т. Таб10 летки могут быть покрыты известными способами.
Жидкие препараты для орального применения могут быть в виде масляных или водных суспензий, растворов, эмульсий, cHpoIIGB или могjT быть выпущены как сухие продукты, подлежащие смешиванию с водой или другими подходящими носителями при использовании. Жидкие препараты для орального использования могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные добавки, . такие как, например, суспендирующие агенты, например метилцеллю25 лозу, сироп сорбита, сахарный сироп, оксиэтилцеллюлозу, желатин, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия, гидрированные съедобные жиры и масла, эмульгирующие агенты, например камедь, лецитин, 30 моноолеат сорбита; неводные носители, например этиловый спирт, пропиленгликоль, сложные. эфиры масел, фракционированное кокосовое масло, миндальное масло, и консерванты, например метил-П-оксибензоат, пропил-Д-оксибензоат, сорбитовая кислота.
Свечи могут содержать основы для свечей, подобные кокосовому мас: лу и различным глицеридам.
Составы для инъекций могут быть приготовлены н виде единиц дозы в ампулах или водных носителях, и в случае необходимости они могут содержать формулирующие агенты: суспендирующие, диспергирующие и стабилизирующие. Антибиотик может быть приготовлен в виде порошка, способного -быть восстановленным и свободной от пирогенон стерильной воде перед использованием.
Составы, содержащие антибиотик
PS-б или PS-7 и/или тритиловые эфиры антибиотиков PS-б или PS-7, могут быть приготовлены н различных формах, подходящих для абсорбции через слизистые оболочки носа, горла и бронхи, например в форме порошка или распыливаемой жидкости, ингаляционных препаратов, таблеток, горловых смазок. Для лечения ушей и глаз антибиотики могут быть приготовлены в виде индивидуальных капсул, в виде капель, в жидкой или полутвердой форме, могут быть представлены также в виде
1039446
10
20
Так как антибиотик PS-6 или PS-7 и их тритиловые сложные эфиры об- ладают синергетическим действием . 30 на различные бактерии, продуциру-. ющие -лактамазу в сочетании с P-лактамными соединениями, их объединяют с (--лактамными соединениями в фармацевтических составах 35.
В качестве (--лактамных соединений могут быть использованы производные пенициллина, такие как бензилпенициллин, феноксиметилпенициллин, карбенициллин, амплициллин и амоксициллин, и производные цефалоспо- . 40 рина, такие как цефалоридин, цефалотин, цефазолин, цефалексин, цефокситин, цефастрил, цефамандол, цефапирин, цефрадин и цефалоглицин. Антибиотик Р$-6 или PS-7 и/или их 45 тритиловые сложные эфиры сочетают c одним или несколькими представителями Р -лактамных соединений. Желатель но использоватЬ количественное соотношение антибиотика к известномУ 50 -лактамному соединению (иям) в интервале от 20:1 до 1:150, предпочтительно от 10:1 до 1:100.
При лечении бактериальных инфекций у людей доза антибиотика PS-6 или PS-7 и/или их тритилового сложного эфира может меняться в зависимости от объекта, подлежащего лечению, веса тела, типа, тяжести и симптомов инфекции, способа и числа приемов лекарства. Для обычного орального или парентерального введения удобно использовать дневную дозу в интервале 0,05-500 мг/кг, предпочтительно 0,5-200 мг/кг при дробной дозировке. 65
0,3
0 5
0,1
0,5
0,5
Производящая среда
AG-1 среда вес/объем
1,5
Глюкоза, %
Кукурузный крахмал, %
Жидкость от замачивания кукурузы, %
Сухие дрожжи,В
Д,L-метионин, В
Со С12 6Н 0, рН перед стерилизацией
2,5
2,0
1,0
0,1
0,00013
7,2
AGA-2 среда
-Глюкоз а, %
Картофельный .крахмал, В вес/объем1,5
2,5 рецептур в гидрофильных или гидрофобных основаниях, таких как порош ки, лосьоны, кремы или мази.
В дополнение к носителю составы могут содержать другие ингредиенты, например консерванты, антиоксиданты, смазки, агенты, влияющие на вязкость, отдушивающие агенты, суспендирующие агенты, связующие и стабилизирующие агенты.
Антибиотик PS-. 6 или PS-.7 и/или .их тритиловые сложные эфиры, пред- назначенные для использования в ветеринарии, например, для лечения инфекции у свиней, коров, овец, кур, могут представлять собой внутригрудные рецептуры в основаниях продолжительного действия или быстро высвобождающих основаниях или в виде концентратов для пищевых добавок.
Фармацевтические составы могут содержать антибиотик PS-6 или PS-7 (и/или их тритиловые эфиры) в качестве единственного активного ингредиента или в сочетании с другими терапевтическими эффективными ингредиентами.
Антибиотик PS-6 или PS-7 и/или их тритиловые сложные эфиры могут быть использованы в фармацевтических составах или могут быть добавлены непосредственно или в виде
5 концентрированных пищевых добавок в пищу животным. Кроме того, они могут быть использованы в качестве ингредиентов для пищевых консерван. тов или дезинфицирующих средств °
О
Пример 1. Стерилизуют при
20 С в течение 15 мин 500 мл колбу
Эрленмейера, содержащую посевную культуральную среду (SE-4). К хорошо спорулированной скошенной культуре Streptomyces sp. A 271 приливают 10 мл 0,02%-ного раствора Твин-80 (поверхностно активный агент) и слегка перемешивают для получения суспензии спор. Инокулируют 1 мл суспензии спор в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл и культивируют при встряхивании при .28 С в течение
48 ч на вращающемся встряхивателе (200 об/мин, радиус цикла 3,5 cM).
Затем 2 мл посевной культуры инокулируют в колбу Эрленмейера емкостью
500 мл, содержащую 100 мл следующей производящей среды и культивируют при встряхивании в течение 48-96 ч при 28 С на вращающемся встряхиваюо щем устройстве.
Посевная культураль.ная среда.(SE-4) вес/объем
Экстракт говядины, В
Бакто-триптон,Ъ
Глюкоза, Ъ
Растворимый крахмал, Ъ 2,4
Дрожжевой экстракт, %
Карбонат кальция, Ъ 0,4
Обезжиренная соевая мука, % рН перед стерилизацией 7,5
1039446
17
Жидкость от замачивания кукурузы, Ъ
Сухие дрожжи, Ъ
CoCIt 6Н О, Ъ
ЛСВ среда
2,0
1,0
0,00013 вес/объем
3,0
1,0 .1,0
0,0001
6 5 вес/объем
AG8-41 среда
5,0
7,0 вес/объем
4,0
0,5
0,2
0,2
0,5
0,5
0,5
0,2
AGO-1 среда вес/объем
Небольшое количество культурального бульона берут из каждой колбы для пробы через регулярные промежутки времени. Активные компоненты в образцах экстрагируют, концентрируют и определяют наличие антибиотиков PS-6 и PS-7 с помощью хроматографии на бумаге и биоаутографии.
Определение антибиотика PS-6.
Элюируют 10 мл надосадочной жидкости отцентрифугированного культурального бульона в ииниколонке, содержащей 1,5 мл Диайон HP-20. После абсорбции активного компонента его элюируют водным ацетоновым растМальтоза, Ъ
Жидкость от замачивания кукурузы, Ъ
Сухие дрожжи, Ъ
СОС12 бн10. Ъ рН перед стерилизацией
Мальтоза, Ъ.
Растворимый крахмал, Ъ
Глицерин, Ъ
Сухие дрожжи, Ъ
NaCl, Ъ
К1НРО4 Ъ
MgS04 7нто, Ъ.
СаСО . СоС1 ° 6Н10, Ъ рН перед стерилизацией
ML-19 среда
Глицерин, Ъ
Пептон, Ъ
Глюкоза, Ъ
Картофельный крахмал, Ъ
Обезжиренная соевая мука, Ъ
Сухие дрожжи, Ъ
NaCI, Ъ
СаСО, .Ъ
Соевое масло, Ъ
Сухие дрожжи, Ъ
NaCl, Ъ
К<НРо4 Ъ
МКЗО4 7Н1О Ъ
СаСО, Ъ
Со CI1 ° 7Н 0, Ъ рН перед стерилизацией
1, 0
0,3
2,5
0 5
0,05
0,05
0,3
0,00013
* 3,0
2,0
0,5
0,05
0,05
0,3
0,00013
7,0
10 проведения испытаний и для биоаутографии, используя различные виды микроорганизмов, на 15-30 мин. Затем удаляют фильтровальную бумагу, а пластину для испытаний культивируют при ЗООC в течение 18 ч..Образец, включающий антибиотик PS-б, образует зону ингибирования при положении
RI антибиотика PS-б. Определяют ан