Способ определения активности дегидрогеназ крови

Способ определения активности дегидрогеназ крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

g(5D G 01 N 33/50 //С 12 Q 1/66

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

fl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

В », ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ;". -:: " / (56) 1. Yablonski E., М.De Luca, Immobilization of bacterial .lucifeFase

and oxidoreductase and. assay using

immobilised enzymes . Methods of enzymology,. 1978, v. 57, р.. 202.

2. Amador Е., L.E.Dorfman, ;W.Е.С.Wacker, Serum lactic dehydro-, :genase activity. Analytical assignment of carr nt assay.- Clin. Chem, 9 391, 1963

3. Шумихин В.Н., Данилов В.С.,, Малков Ю.A., Егоров Н.С. Выделение

:,и очистка бактериальной люциферазы

-т

Hl МЮ

К ABTOPGHOMY. СВИДЕТЕЛЬСТВУ ( (21) 3302146/28-13 (22) 11.06 ° 81 (46) 23.09 ° 83. Бюл. 9 35 (72) В..С.Данилов, О.A.Беляева, A..Д.Исмаилов. и Н.С.Егоров (71) Московский ордена Ленина, орде-.- на Октябрьской Революции и ордена, Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.B.Ëoìoío: сова (53) 577;:15 (088.8) для аналитических целей ss Phptobacterium fischeri. Биохимия, 1980, 45.9, 1 576-1581. (54)(5"7) .1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ДЕГИДРОГЕНАЗ КРОВИ, предусматривающий инкубацию исследуемой жидкости с субстратом определяемого фермента в присутствии никотинамидадениндинуклеотида в буферной среде, отличающийся тем, что, .с целью повыщения чувствительности способа, инкубацию осуществляют при рН 7,0-8,5 при содержании субстрата в смеси 10 -10 М, никотинамидадениндинуклеотида — 104-1бЪ и при дополнительном введении в инкубационную среду алифатического альдегида-дека- Е

Ф

Наля в количестве 10 -10 М, флавинмононуклеотида - 10- -107M и раствора бактериальной люцифараэы Photobacterium fiecberi о общим соиерианием белка 1.104-1,0 мг, с последующим измерением уровня биолюминесценции смеси, по которому с помощью калибровочной кривой определяют активность фермента.

1043568 крови, разбавленную в 101000 раэ в количестве

2.Способ поп.1,отличающ и и .с я тем, что в каЧестве исследуемой жидкости используют сыворотку

0,005-1 мл.

t 2

Изобретение,относится к способам рофотометрированивм образующегося определения ферментов и может быть восстановленного НАД по количес применено,в микробиологической и-ме- которого определяют активность дегид-. дицинской отраслях промышленности, рогенаэы (2). .гематологии, физиологии и аналити- 5 Известный способ позволяет рабоческой химии. тать со сложными естественными биоло гцческими жидкостями, однако он облаИзвестны различные способы опре- дает следующими недостатками †. невы» деления активности дегидрогеназ, .сокой чувствительностью (не выше. основанные на проведении ферментатив- 1O 10 моль НАДН), невысокой надежностью ной реакции с .последующим учетом про- (спектрофотометрирование в присутст-, . дуктов реакции либо регистрацией про- вии посторонних дегидрогеназ в анали. исходящих в ходе ее .сопутствующих яв- эируемом Растворе), незкономичностью лений, Применяемые .способы условно (для пРименения способа необходима могут быть охарактеризованы.как коло- дорогостоящаs высoкочувствительная риметричвский, спектрофотометричес-,спектральная аппаратура).кий и биолюминесцентный. : целью изобретения является повышеИзвестен наиболее чувствительный ние чувствительности способа опредеи перспективный биолюминесцентный ления ° .способ, заключающийся в смешении раст-. .: Поставленная цель достигается тем, -вора аналиэируемой дегидрогеназы с что согласно способу определения ак-. никотинамидадениндинуклеотидом (НАД), тивности дегидрогеназ крови, предуссубстратом, иммобилизованными НАдН, матривающему инкубацию исследуемой

ФМН-оксидоредуктазой и бактериальной . жидкости c субстратом определяемого люцифераэой и регистрации биолюминес.- ФеРмента B присутствии яикотинамидч . ценции, по уровню которой судят об :адениндинуклеотида в буферной среде, 25 активности фермента дегидрогеназы. йнкубацию осуществляют при РН 7,0-8,5

Чувствительность способа при анализе : при содержании субстрата в,смеси 10 .чистых растворов индивидуальных де- 10 М, никотинамидадениндинуклеотида гидрогеназ 10 -10 б моль (,1) . - 10 -10 м и при дополнительном введе.Недостатки данного способа -, невы- 30. нии в инкубационную среду алифатисокая стабильность фермента (фермент, ческого альдегида-деканаля в коли-.

-в иммобилизованном виде стабилен не честве 10 -lO М, флавинмононуклеоболее 1,5.-2 мес.), а также невоэмож-. тида - 10 -10 М и раствора бактериность использования в анализе смеси алкиной люцифераэы Photobacterium веществ и биологических тканях вслед- 35 fischeri с .общим содержанием белка стэне.подверженности денатурации. .1 ° 10 -1,0 мг, с последующим измереДанный способ при анализе дегид-,нием уровня биолюминесценции смеси, .Рогенаэ в смеси веществ сыворотки . по которому с помощью калибровочной крови оказывается малопригодным кривой определяют активность Фермен-, вследствие побочных влияний компонен- 4О та. тов сыворотки на люциферазу., Чувст- . Причем в качестве исследуемой жид вительность способа в .таких средах. кости исйользуют сыворотку крови, значительно ниже, чем в чистых раст- Разбавленную в 10-1000 раэ в. коли ворах -индивидуальных дегидрогеназ, . честве 0,005-1 m. а воспроизводимость результатов не-, - Способ осуществляют следующим

:удовлетворительна, что делает способ. образом. малопригодным для использования в Берут сыворотку крови,. Разбавляют естественных биологических средах, ее в 10-1000 раэ смешивают 0,005Наиболее близким к изобретению по . 1 im разбавленной сыворотки крови с достигаемому результату является люцифераэиой смесью, содержащей ни спектрофотометрический способ оцре- -@ котииаещаданкндинуклеотид (НАД) ко деления активности дегидрогеиаз кро- нечиой концентрации 0,0001 - ЧГ,01 Щ .ви, предусматривающий инкубацию ис- 0,01 - 0,1 мл. алифатического альдеследуемой жидкости с субстратом оп- гида .- декунала с коначаой конаант . Ределяемого фермента (77,.5 МИ) в при- рацией.10 10 Му 0,01-0,1 мл флавинс тстэии нАД .(6,25,мм) в буферной 55 мононуклеотыда о конечной концентрасреде при РН 8,8 с последующим спект щей .10 -10 Ng 0,01 0,1 ..мл бактари-, 1043568 альной люцифераэы с конечной кон центрацией по белку 0,01-10 мг в

0,1-1,0 мл 0,1 М фосфатного буфера (РН 7,0-8,5), добавляют субстрат ана лизируемой дегидрогеназы конечной концентрации 0,001-0,05 N и опреде5 ляют уровень биолюминесценции смеси за, l — 5.мин.

Предлагаемый способ требует незначительных количеств крови (для ана-. лиза достаточно 10 мкл разбавленной в 3.00 раэ сыворотки или лиофилизован ной плазмы крови), чувствительность его выше, чем у известных (спектро скопических и .Флуориметрических),< для анализа дегидрогенаэ.в крови:s . 35 100-1000 раз, а проведение способа. требует незначительных затрат времени.

На фиг. 1 изображена зависимость интенсивности биолюминесценции люци, феразной смеси от увеличения концентрации сыворотки крови в присутствии лактата (что характеризует активность лактатдегидрогеназы крови) íà фиг..2- . ., зависимость интенсивности биолюми+ несценции люциферазной смеси от увеличения концентраций лиофилизованной плазмы крови в присутствии малата (что характеризует активность малатдегидрогенаэы) на фиг. 3 — зависимость интенсивности биолюминесцекции люциферазной смеси от увеличения концентрации лиофилизрванной плазмы кро-. .ви, предварительно. подвергнутой йагреванию до 60 H 65 в присутствии лактата (что характеризует активйость 5 изоферментов лактатдегидрогеназы}:..

Бактериальную люциферазу .получают на основе. известного способа -(3) . . Бактерии выращивают на среде, содержащей, г/л:. пептон 10, глицерин З..мл;40 дрожжевой экстракт 2 КаС1 39;

На2НРО4 .5,3ф КН РО4 2,1; . (НН4) НР04

0 5 NgSO4 0 l, pH 7,4 при 25 С, ао держании кислорода 4-10% в теченйе.. .16 ч, сепарируют, разрушают под .прес- 45 сом при температуре жидкого азота, хроматографируют на ионоо -.меннике:.

ДЕЛЕ - 50 в 20-50Ъ-ном этиленглико-. левом буфере и либо перерастворяют.в

0,05 N триэтиламин-HCl буфере, добав- 5() ляя BSA 0,1 мг/мл, .и лиофилиэирувт либо осаждают 80%-ным сульфатом .азе-. .мония и хранят при -20ОС. .::. . с

Способ поэволяет получать прейарат люциферазы с высокой стабильнф :; тью, т..е. препарат люциферазы g-лйо- филизованном виде теряет за год. при хранении при 20аС активность до.

5-10%,: препарат в.сульфате аммония при хранении в тех же условиях брак=. тически не теряет в течение года :-;.. своей активности.

П р и и е р 1. Определение актив" . ности лактатдегидрогеназы в сыво М>т" ке крови человека при использовании лиофилизованного препарата бактери-. 65 альной люциферазы с содержанием белка 0,1 мг/мл с удельной активностью

10 квант/с.мг белка. "

Приготавливают растворы фосфатного буфера, бактериальной люциферазы в фосфатном буфере, субстрата анализируемой дегицрогеназы, НАД, ФИН, альдегида-деканаля, сыворотки крови человека в, различных разведениях в фосфатном буфере.

Берут набор стеклянных стаканчиков. (5-20 шт.) и во всех стаканчиках готовят люциферазную смесь, содержащую 600 мкл 0,1 М Иа-фосфатного буфера (рН 8,0), 10 мкл 0,01 М НАД,.

40 мкл 0,001 Й ФИН, 100 мкл лактата

На, 0,1 М люциферазу (0,1 мг/mr).

В стаканчик с люциферазной смесью, содержащей субстрат анализируемой дегидрогеназы — лактат, добавляют

10 мкл разбавленной сыворотки крови, помещают в кюветное отделение фотометра с-детектором света и определяют интенсивность люминесценции смеси за.определенный промежуток времени (1 мин). Интенсивность люминесценции выражают в милли(макро) вольтах или в квантах в секунду (1 мВ равен

)О ° 10 квант/с). Полученную интенсив-го ность люминесценции, используя калибровочную кривую люминесценции от

НАЦН, выражают в единицах активности фермента - моль НАДН/мин/мл. . На фиг. 1 приведена зависимость интенсивности биолюминесценции люциферазной смеси и активности лактатдегидрогенаэы от концентрации сыво-. ротки крови человека. Видно, что с увеличением концентрации сыворотки линейно увеличивается интенсивность иолюминесценцик. Таким образом, мож- . но сделать.вйвод, что, например,,04.Ъ раствор сыворотки крови содер+ жит лактатдегидрогеназу, вызывающую увеличенйе люминесценций смеси на

5 мВ (5,5 ° 10"квант/с), что соответстзует изменению активности лактатдегидрогеназы на 7 10 " моль НАДН/ мнн/мл.

П, р и м е р 2. Определение. активности малатдегидрогеназы крови челоека при использовании лиофилизованного препарата бактериальной люЦифе= разы .с содержанием белка 0,1 мг/мп, удельной активностью 10 квант/с<

r белка.

Препарат люциферазы получают аналогично примеру 1. Люциферазная смесь готовится из тех же веществ и той.же пропорции, что и в примере 1, с той лишь разницей, что в качестве субстрата анализируемой дегидрогеназы добавляют 10 мкл малата с конечной концентрацией 10 мИ.

B стаканчик с люциферазной смесью„ содержащей.малат, вносят сывороткукрови и измеряют уровень люминесценции за 1 мин. По калибровочной

1043568

5 кривой интенсивность люминесценции в милли(микро) вольтах выражают в единицах активности фермента - моль

НЛДН/мин/мл.

На фиг. 2 приведена зависимость интенсивности люминесценции люцифераэной смеси. с малатом от концентрации сыворотки крови. Видно, что добавление. 0,2% раствора сыворотки крови вызывает возрастание люминесцен ции смеси на 5 мВ, что соответству- 10 .ет изменению активности малатдегидрогеназы йа 6 ° 10 . моль НАДИ/мин/мл.

Пример 3. Определение активности изоферментов лактатдегидрогенаэы в лиофилиэованной плазме крови 15 человека с помощью препарата бактериальной люциферазы в сульфате аммония с содержанием белка 0,2 мг/мл с удельной активностью 10 квант/с мг белка. .20

Препарат люциферазы получен иэ бактерий, выращенных в описанных условиях, отличающихся тем, что, посде хроматографирования на ионообменни-, ке ДЕЛЕ-50 и переосаждения в триэтил-

HCl буфер, препарат подвергается высаливанию 80%-ным сульфатом аммония, осаждается центрифугированием при

18000С и хранится при -20ОC в сульфате аммония.

Берут лиофЫизованную плаву кро- 3 ви, растворяют ее в 0,1 М фосфатном буфере, помещают раствор .плазмы крови в термостат и выдерживают, 15 мин при 60 С (получают тврмостабильные изоферменты лактатдегидрогеназы

ЛД-1,2) или при 65 С (получают термостабильный изофермент ЛД-l, после чего подвергают плазму .быстрому охлаждению во льду.

Полученную плазму крови,добавля- 40 ют к люциферазной смеси, приготовленной по методике, описанной в примере

1, и измеряют уровень люминесценции смеси, по которому судят об активности изоферментов лактатдегидрогеназы.

На фиг. 3 приведена зависимость интенсивности люминесценции смеси от концентраЦии плазмы, прогретой до 60" (кривая 1) и до 65 (кривая 2) в присутствии лактата - lla.

Видно, что с увеличением концентрации плазмы крови линейно возрастает активность люминесценции. Увеличение койцентрации плазмы на 0,4 мг/мл вызывает возрастание люминесценции на 18 мВ (ЛД-1) или на 35 мВ (ЛД-1,2)

Это изменение люминесценции смеси соответствует изменению активности

ЛД-1,2 на 2,3 10 "моль .НАДИ и ЛД-1,3 на 4,5 ° 10 "моль НАДИ/мин/мл.

Изобретение обеспечивает повышение чуствительности способа (по срав нению. с известными способами определения активности дегидрогеназ крови предлагаемый позволяет: повысить чувствительность до 10"" 10 моль), повышение экономичности способа (препа" рат люциферазы для указанных целей получают по,простой методике очистки, что удешевляет препарат), на из-мерение активности ферментов используют незначительные количества сыворотки или лиофилизованной плазмы крови. Препарат не подвергается денату-. рирующему воздействию компонентов крови, что позволяет использовать его для анализа в смеси веществ. Препарат люциферазы эффективен в широком диапазоне рН и .температур (рН

5,5 -8,.5g.Т вЂ” 5-25 С), что существенно расширяет возможности его применения. Предлагаемые для использования в анализе препараты люциферазы обладают устойчивой кинетикой свечения и высокой стабильностью..

1043568 ав

ЕО ptr мл (люзов) 00

Фиг. Я

Составитель О. Скородумова

Редактор Н. джугаи Техред И.Гайду Корректор A,ÄÝßTÌÎ

4» «««» «« ««««»

Заказ 7331/48 Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ ГосударствеННОго коМитвта СССР по делам изобретений И открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5

« ««

Филиал ППП Патент, r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4