Способ выделения гиалуронидазы

Способ выделения гиалуронидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЕ . из культуральной жидкости патогенного штамма-продуцента путем осаждения фермента этиловым спиртом в соотношении 1:1, отделениями растворения отгадка с последующей хроматографической очисткой на полисахаридном сорбенте, отличающийся тем, что, с целью повыиления чистоты целевого продукта, используют культуральную жидкость штамма Staphy2OCOCCUS aPbus 0-15, в качестве сорбента используют диэтилг аминоэтилцеллюлозу,причем при хроматографии сорбцию ведут в условиях 0,006 М фосфатного буфера с рН 7,0-7,2, а элюцию осуществляют О ,06 М фосфатным буфером при тех же значеО ) ниях рН. | со СП til 4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTGPCHGMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3351347/28-13 (22) 06.07.81 (46) 23.10.83. Бюл, Р 39 (72) Ц.С.Турманидзе, Т.Г.Чанишивили, Г.И,Квеситадзе, Т.В.Биркадзе, Ю.С.Миканадзе, Г.Л.Броладзе, С.И.Анфимова и Д.А.Долидзе (71) Институт биохимии растений

AH Грузинской ССР и Тбилисский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (53) 577.15.07(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Р 632703, кл. С 12 N 9/26, 1977.

2. Трояшкин А.А. Получение и определение активности стафилококковой гиалуронидазы. Труды Ленинградского санитарно-гигиенического мединститута, 1978, т,120, с. 80-82.

3. Климачева Л.В. и Исполатинс"= кая М.В. Выделение и некоторые свой.— ства гиалуронидазы СР.perfringens.— Вопросы медицинской химии, 1970, т, ХУ1, вып.4, с.381,-386.

„„SU„„1049544 A

3(51). С 12 N 9/26; С 12 R 1/44 (54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ из культуральной жидкости патогенного штамма-продуцента путем осаждения фермента этиловым спиртом в соотношении 1:1, отделения и растворения осадка с последующей хроматографической очисткой на полисахаридном сорбенте, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, используют культуральную жидкость штамма Staphylococcus аРЬцв 0-15, в качестве сорбента используют диэтил. аминоэтилцеллюлозу,причем при хроматографии сорбцию ведут в условиях

0,006 М фосфатного буфера с рН

7,0-7,2, а элюцию осуществляют 0,06 h1 Е фосфатным буфером при тех же значениях рН.

1049544

Изобретение относится к ферментнбй промышленности, в частности к способам получения высокоочищенной гиалуронидазы из патогенных микроорганизмов.

Известны способы получения тести кулярной гиалуронидазы, в частности гиалуронидазы из бычьих семенников, из хрусталика глаза Г1 <.

Однако указанное сырье является дорогостоящим и дефицитным, что ограничивает получение фермента в достаточном количестве.

Известны также способы получения гиалуронидазы на основе микроорганизмов как патогенных„ так и непатогенных.

Среди непатогенных микроорганизмов редко встречаются продуценты гиалуронидазы. Более распространенными являются способы выделения гиалуронидазы из культуральных жидкостей патогенных микробов.

Известен способ выделения гиалуI ронидазы из культуральной жидкости патогенного штамма стафилококка путем осаждения фермен G сернокислыми солями.

Получают нео>ище..ный ;Ферментный препарат, выход и активность которого не охарактеризованы (2 7.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ выделения гиалуронидазы из культуральной жид!<Ости пдто . енного штам ма-продуцента C Fcs Er i<1iu-.in— уепз путем осаждения сульфатом аммо. ния, диализа, повторного осаждения сульфатом аммония, растворения осадка, осаждения зтиловым спиртом при соотно<венин 1:1, отделения и растворения осац«а с последующей хроматографической очисткой на диэтиламиноэтилсефадексе Л-50, причем собцию ведут в условиях 0,1 М трисбуфера (pH 7, 5), а эл<оцию осуществляют 1N МаСс в том же буфере (3 ).

Получаемый продукт обладает значительной чистотой,. однако при проверке чистоты выделенной гиалуронида зы методом злектрофореза установлено, что она состоит из двух злектрофоретических фракций.

Цель изобретения — повышение чистоты целевого продукта.

Указанная цель достигается предлагаемым способом выделения гиалуронидазы из культуральной жидкости патогенного штамма-продуцента путем осаждения фермента этиловым спиртом в соотношении 1:1, отделения и растворения осадка с последующей хроматографической очисткой на полисахаридном сорбенте, причем используют культуральную жидкость штам ма Staphy Pococcus а< 1>цв 0-15, в качестве сорбента используют диэтиламинозтилцеллюлозу, причем при хрома тографии сорбцию ведут в условиях 0,006 М Фосфатного буфера с рН

7,0-7,20,а элюцию осуществляют 0,06 М фосфатным буфером при тех же зна5 чениях рН, Предлагаемый способ позволяет отделить примесные белки и сопутствующие токсины и получить электрофоретически гомогенную гиалуронидазу, 10 что обусловлено свойствами культуральной жидкости указанного штамма и определенными условиями хроматографии .

Кроме того, предлагаемый способ является более простым, состоит из меньшего числа стадий, чем известный.

Пример. Продуцент St.ай>ив

0-15 культивируют в течение 5 сут на среде, содержащей кислотный гидролиэат козеина, экстракт отрубей, дрожжевой экстракт и однозамещенный

Фосфат калия.

Иикробные клетки отделяют сепарированием. К 1 л культуральной жидкости добавляют 1 л охлажденного

96:-ного этилового спирта, выдерживают в холодильнике 30 мин, центри" фугируют при 3000 об/мин в течение

1.0 мин. Осадок растворяют в 50 мл

ЗО дистиллированной воды и лиофильно высушивают„ Получают порошок с активностью около 12 ед/мг.

Выход фермента по активности составляет около 90% от исходной

3-" активнос-..и в культуральной жидкости,, Из 1 л культуральной жидкости получают 1,070 г лиофильно высушенного ферментного препарата.

100 мг полученного Ферментного препарата растворяют в 0,006 М Фосфа-.íoì буфере с рН 7,0 и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой в

0Н -форме. Высота колонки 22 см, высота слоя 15 см, диаметр колонки

2 см, скорость нанесения 1 капля в

15 с, Недсорбнрованный белок выливают из колонки тем же буфером. Активну><> Фракцию гиалуронидазы эллюируют фосфатным буфером с рН 7,0 и ионной силой 0,06 М. В элюате удель. ная активность гиалуронидазы состав. ляет 72 ед/мг белка. Элюат высушивают лиофильно.

Активность гиалуронидазы определяют турбидиметрическим методом.

Гомогенность полученного фермента определяют электрофорезом в полиаK риламидном геле при кислом и щелочном значениях рН среды.

Выделенная гиалуронидаза электроб0 Форетически гомогенна, имеет активность 67000-120000 турбидиметрических единиц на 1 r.

Выход целевого продукта 62% по сравнению с исходной активностью в культуральной жидкости.

1049544

Составитель О.Скородумова

Редактор Г.Безвершенко Техред T. анта Корректор Л. Патай

Заказ 8361/28 Тираж- 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москвà, %-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образом, предлагаемый способ получения фермента гиалуронидазы легко воспроизводим и не требует специального сложного аппаратурного оформления.

Фе рмен т гиалуронида за, полученныйый предлагаемым способом, Обладает высокой удельной активностью, гомогенен злектрофоретически и полностью свободен от токсических компонентов.