Способ определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек

Способ определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕД|ЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЕКРЕТЕ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК; включающий размещение исследуемого ма. гериала и материала с эталонной концент рацией иммуноглобулинов на поверхности гелеобразной среды, coAtepKameft антитела против исследуемых иммуноглобулинов, измерение зон преципитации по осуществлению реакции иммунодиффузии и Определение концентрации данного вещества в исследуемом материале по графикам, выражающим зависимость диаметра зоны преципитаций от концентрации эталонов иммуноглобулинов , отличающийс} тем, что, с целью повышения точности локального определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек, используют нативный материал, забираемый с помощью стандартных дисков из фильтровальной бумаги, а для сравнения используют аналогичные диски, пропитанные эталонными концентрациями данного вида антител.

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, уъ

К ABTOPCHOt4V СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1-ОСУДАРСТ ЕНН 1й НОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И СТНРЬФИЙ (21) 2757139/28-13 (22),24.04.79 (46) 30.10.83, Бюл. № 40 (72) 1О. И. Ляшенко (53) 596.8.077 (088.8) (56) 1. Mancini G. (;arbonara A., Негетацз I, Immunochemieal quantitation of antigen by, yngle radar а1 инпшсй11из1оп.— Immunoche

nistry, 1965, voI. 2, № 1, р. 235 — 254. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОН-.

ЦЕНТРАЦИИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

В СЕКРЕТЕ .СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК; включающий размещение исследуемого ма-, гериала н материала с эталонной концент рацией иммуноглобулинов на поверхности гелеобразной среды, содержащей антитела

„„SU„„1050668 А зг5ц . А 61 В 10100; А 61 К 39!395 против исследуемых иммуноглобулинов, измерение зон преципитации по осуществлению реакции иммунодиффузии и определе-. ние концентрации данного вещества в исследуемом материале по графикам, выражающим зависимость диаметра зоны преципитации от концентрации эталонов иммуноглобулинов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности локального . определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек, используют нативный материал, забираемый с помощью стандартных дисков из фильтровальной бумаги. а для сравнения используют аналогичные диски, пропитанные эталонными концентрациями данного вида антител. 1050668

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и касается методики исследования секреторных антител (имму-, ноглобулинов), которые играют важную роль в защите организма от инфекции. Иммуиоглобулины синтезируются лимфоидными клетками, расположеннымн в толще слизистых оболочек, и выделяются вместе со слизью на ее поверхнос ь.

Известен способ определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слиэис.: 10 тых оболочек, использующий реакцию радиальной нммунодиффузии (РИД) в araре по Mancini (1965), которая основана на способности иммуноглобулинов биологических жидкостей образовывать преципитат при соединении с антителамн против данного вида иммуноглобулинов r lj.

При таком способе и 1,5-За 0-ный агар, приготовленный íà 0,1 М мединал-верона-, ловом буфере (рН 8,6), вносятся антитела: против исследуемого вида иммуноглобули- щ нов. В сделанные в агаре с антителами против lg лунки вносятся эталоны различной: концентрации данного вида иммуноглобули-, нов. В такие же лунки вносится исследуемый материал. В результате взаимодей. ствия иммуиоглобулинов, содержащихся в исследуемом материале, и антител, на-

:ходящихся в arape, вокруг лунок образуются округлой формы зоны прецнпитации.

Их диаметр. находится в линейной зависимости от концентрации иммуноглобулинов, 3р чаходящнхся в лунках, По графикам, выражающим зависимость диаметра зоны преципитации от концентрации эталонов иммуноглобулинов„определяют концентрацию данного вещества в исследуемом материале. Однако такой .способ неприемлем для .35 определения концентрации иммуноглобулинов в секретах верхних дыхательных путей, миндалин, кишечника и т.д., которые забирать s. нативном состоянии невозможно из-за незначительного их количества (они 40 покрывают слизистую оболочку в виде тонкого слоя влаги). В связи с указанным обстоятельством секрет слизистой оболочки забирают путем промывания оболочки буферными растворами хлорида натрия и исследуют иммуноглобулнны в смывах. Резуль-, 45 таты такого исследования не дают достаточной точности, так как объем смываемого материала может колебаться в больших диапазонах., Цель изобретения — повышение точности локального определения концентрации 50 иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек, Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек, включающему размещение исследуемого материала и материала с эта. лонной концентрацией иммуиоглобулинов на поверхности гелеобразиой среды, содер жащей антитела против исследуемых имму. ноглобулннов, измерение эон преципитации по осуществлению реакции иммунодиффузии н определение концентрации данного вещест. ва в исследуемом материале по графикам, выражающим зависимость диаметра зоны приципитации от концентрации эталонов иммуноглобулинов, используют нативный материал, эабираемый с помощью стан-, дартных дисков из фильтровальной бумаги, а для сравнения используют аналогичные диски, пропитанные эталонными концентрациями данного вида антител.

Способ осуществляют следующим образом. У

Для забора материала (секрета слизистых оболочек) применяют стандартные дис-. ки из фильтровальной бумаги ГОСТ - 120

26-66, диаметром 7 мм, Материал из слизистых оболочек забирают путем приклады-; вания дисков к поверхности слизистых оболочек до тех пор, пока они не пропитаются секретом (до появления на поверхности диска избытка жидкости). Избыток секрета снимают с диска путем проникновения их к листу мелованной бумаги.

Поскольку диски являются стандартными, каждый из них способен впитать практически один и тот же объем секрета. Про- питанные исследуемым материалом диски высушивают и хранят до момента проведения исследований в безводной атмосфере, в эксикаторе с . помощью влагопоглотителя (пятиокись фосфора и др.).

В таком состоянии они сохраняются без потери содержания им муноглобули нов в течение 3 мес.

Исследование концентрации иммуноглобули нов в дисках, пропитанных секретом слизистой оболочки, осуществляют в реакции радиальной иммунодиффуэии в агаре.

Для этого используют 1,5%-ый агар Дифко, приготовленный .на 0,05 М мединал-вероналовом буфере (рН 8,6). Антисыворотку против соответствующих видов иммуноглобулинов вносят в расплавленный агар при температуре среды, равной 56 С. Количество сыворотки, которое необходимо внести в агар, определяют опытным путем.

Обычно ее применяют в два раза меньшем количестве, чем при исследовании сывороточных иммуноглобулинов. Смесь агара и антисыворотки выливают в емкость, образованную двумя стеклянными пластинами размером 9х12 см и П-образной рамкой, располагаемой между ними {толщина рамки l мм). После остываняя агара одну из пластин снимают путем скольжения по поверхности застывшей среды., Ha освобо-, дившуюся поверхность агара с антисыворот-, кой против определенного вида иммуногло- булинов в соответствии с заранее иэготовлеи1 ным трафаретом раскладывают диски, про4 з питанные исследуемым секретом, а также диски, проп/ита нные эталонными концентрациями исследуемых веществ. Стеклянные пластины со смесью агара и антисыворот . ки и помещенными иа них дисками ставят во влажную камеру при 1 = 18-20 С. Оптимальный срок инкубации составляет 5 сут.

После этого пластины выдерживают 6 ч в изотоническом растворе хлорида натрия, красят в течение 2 ч в 1%- ном растворе амида черного, приготовленного на Зо/о-иом,1О растворе уксусной кислоты, отмывают в

3%-ном растворе уксусной кислоты и изме ряют диаметр зон преципитации вокруг:, каждого из дисков.

На масштабной бумаге строят графики, выражающие зависимость диаметра . зои прецнпитации . от концентрации данного нида антител в диске. По этим графикам определяют концентрацию иммуноглобу-, линов в исследуемом материале.

Как показали сравнительные исследова-: ния концентрации иммуноглобулинов секре. та небных миндалин у здоровых людей и лиц, часто страдающих ангиной, секретор ные иммуноглобулины миндалин представлены ие только 1 4, как это характерно для большинства слизистых оболочек, «о и tq G и частично fy/5e, прн этом была;определена их фактическая концентрация в данном биологическом субстрате. Концентрация иммуноглобулинов у здоровых людей была следующая

1в А=0,73+ 0,06 10, а1 0= 1,8640,18 10 мг/ л, У людей, часто болеющих ангиной, концентрация 1qA соответствовала 0,33 0,02 10,, а 1G — 0,83+,006. 10 г/л.

Предлагаемый способ исследования может быть использован для определения концентрации иммуноглобулинов в секретах, которые получать в натнвйом состоянии известным способом не представляется возможным.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность исследований при локальных определениях кон1.ентраций различных иммуноглобулннов и тем самым повысить их диагностическую ценность.

Редактор П. Макаревич

Заказ 8521/5

Составитель И. Горелова

Техред И. Верес Корректор М. немчик

Тираж 713 Подинсное, ВНИИПИ Государствснного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, ж — 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», r. Ужгород, ул. Проектная, 4