Способ получения сорбента для иммобилизации биологических активных веществ

Способ получения сорбента для иммобилизации биологических активных веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ путем обработки аминопроизводных простых эфиров целлюлозы модифицирукяцих агентом, о т л ичающийся тем, что, с целью создания сорбентов с повышенной сорбционной емкостью по отношению к биологически активньин веществам, аминопроизводные простых эфиров целлюлозы обрабатывают в -нитробензоилавидом при 2О-30°С в течение 4-5 ч с последующим восстановлением нитрогруппы дитионитом натрия при 50-60С в течение 4-5 ч.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (1Щ 111) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3407134/23-05 (22) 12.03.82 (46) 07.11.83. Бвл. В 41 (72) И.К. Клявиньш и A.À. Прикулис (71) Латвийский ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет им. П. Стучки (53) 661.183.123 (088.8) (56) 1. P. Cuafrecasas, Protein

purification by Affinity Chromatography, J. BioI. Chem., 1970, ч 245, М 12, р. 3059.

2. Авторское свидетельство СССР . . В 479782, кл. С 08 В 15/06, 1975 (прототип).

uS11 С 08 В 15/.06, С 08 У 5/204

С 12 Х 11/12 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ COPBEHTA

ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ путем обработки аминопроизводных простых эфиров целлюлозы модифицирующих агентом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью создания сорбентов с повышенной сорбционной емкостью по отношению к биологически активным веществам, аминопроизводные простых эфиров целлюлозы обрабатывают В -нитробензоилазидом при 20-30 С в течение 4-5 ч с последующим восстановлением нитрогруппы дитионитом натрия при 50-60 С в течение 4-5 ч.

". 052509

Изобретение относится к синтетической органической химии, в частности к способу получения сорбентов для иммобилизации биологически активных веществ и может быть использовано в химической промьпиленности для получения биоспецифических сорбентов с целью дальнейшего их использования в биоспецифической хроматографии новом, эффективном методе, позволяющем выделять большинство биологичес- 10 ки активных веществ с высокой степенью очистки, а также в медицине и микробиологии при проведении лабораторных исследований.

Известен способ получения сорбен- 15 та для иммобилизации биологически активных веществ путем обработки исходной матрицы аминопроизводных агароэы A.-нитробензоилазидом с последующим восстановлением его нитрогруппы Щ .

Недостатком этого способа является использование в нем в качестве матрицы агарозы — дорогостоящего реагента, не -выпускаемого отечест. венной промышленностью.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сорбента для иммобилизации биологически активных веществ путем модификации аминопроизводных простых эфиров целлюлозы сероуглеродом и изобутилхлорформиатом, в результате чего получают сорбенты, содержащие изотиоциа,натные группы Г21 .

Однако эти группы пригодны лишь для иммобилизации Ферментов. Кроме того, в качестве модифицирующих агентов используются высокотоксичные вещества, такие как сероугле- 40 род и изобутилхлорформиат, в результате чего способ не имеет практического значения.

Цель изобретения — создание сорбентов с повышенной сорбционной ем- 45 костью по отношению к биологически активным веществам.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента для иммобилизации биологически активных веществ путем обработки аминопроизводных IlpocTblx.ýôèров целлюлозы модифицирующим агентом, аминопроизводные простых эфиров целлюлозы обрабатывают п -нитробензоилазидом при 20-30 С в течение

4-5 ч с последующим восстановлением нитрогруппы дитионитом натрия при

50-60 С в течение 4-5 ч.

После диазотирования полученный сорбент сочетается с широкой группой 60 соединений — ароматическими аминами, фенолами и рядом гетероциклических соединений (субстратамн, ингибыторами, кофакторами Ферментов, белками).

Лминопроизводные простого эфира целлюлозы, например аминоэтилцеллюлоза, 6-аминогексиламид карбоксиметилцеллюлозы или 2-окси-3-(4-аминогексил) аминопропиловый эфйр целлюлоэы, обрабатывают в водном растворе диметилформамиде и -нитробенэоилазидом при 20-30 С в течение 4-5 ч, затем восстанавливают нитрогруппу полученного носителя до аминогруппы дитионитом натрия при 50-60 С в течение 4-5 ч в водной среде, причем каждые 10 г соответствующего эфира целлюлозы обрабатывают 0,525 М раствором и. -нитробензоилазидо в водном растворе диметилформамида, а при восстановлении аминогрупгыиспользугт

0,5 М водный раствор дитионита нат- рия. Выбранные соотношения компонентов реакционной смеси являются оптимальными, их изменение в сторону уменьшения приводит к уменьшению степени замещения, т.е. ухудшению свойств сорбентов, а увеличение соотношения компонентов в реакционной смеси не приводит к улучшению свойств конечного продукта и таким образом не является целесообразным.

Последующая иммобилизация биологически активных веществ протекает путем обработки полученного сорбента азотистой кислотой при 0 С в течение 0,5 ч с последующим сочетанием биологически активных веществ в течение 1 ч.

Пример 1. 50 г аминоэтилцеллюлоэы со степенью замещения

0,52 ммоль/г суспендируют в 200 мл смеси, состоящей из 120 мл 0,2 М боратного буфера рН 9,3 и 80 мл диметилформамида, затем прибавляют раствор 40,32 г (0,21 моль) и -нитробензоилазида в 200 мл диметилформамида и перемешивают при 20 С в течение

4 ч. Полупродукт и-нитробензамидоэтилцеллюлозу отфильтровывают, промывают диметилформамидом, водой и суспендируют в 500 мЛ 0,5 М раствора дитионита натрия в 0,5 М бикарбонате натрия и перемешивают при 50 С в течение 4 ч. Продукт отфильтровывают, промывают водой, диметилформамидом, ацетоном и сушат на воздухе. Содержание продукта 0,50 ммоль на 1 r cyхого сорбента.

В таблице показано влияние параметров синтеза на выход конечного продукта. Загрузка реагентов во всех примерах осуществляется по примеру 1.

Пример 7. Используя в качестве .исходного материала б-аминогексиламид карбоксиметилцеллюлозы со степенью замещения 0,30 ммоль/г и проводя синтез, как указано в примере 3, получают продукт со степенью замещения 0,24 ммоль/г.

Пример 8. Используя в качестве исходного материала 2-окси)пг гп<

Параметры синтеза

Примеры

20

30

4 5

50

50

0,50

0,50 0,50 0,51

0,50

ВНИИПИ Заказ 8787/17 Тираж 494 Подписное

Филиал ППП "Патент", г.ужгород,ул.Проектная,4 — 3 — (ами ног . I! < нл ) il!1и н .гп ()Онилоный эфир целлюлозы со сто.пенью замещения 0,33 ммоль/г и npoBoJlR синтез по примеру 3, получают продукт со степенью замещения 0,28 ммоль/г.

Воэможности использования пблученного сорбента для иммобилизации биологически активных веществ иллюстрируются следующими примерами.

Пример 9. Иммобилизация тирамина (субстрат фермента). 10 r

Ф-аминобензамидоэтилцеллюлозы суспендируют в 200 мл 0,5 н соляной: кислоты, затем охлаждают до 0 С и прибавляют холодный раствор 5 r нитрита натрия в 25 мл воды, пере- 15 мешивают при 0 С в течение 20 мин, затем быстро отфильтровывают, промывают холодной 0,01 н соляной кислотой и суспендируют. в 250 мл холодного (О С) 0,1 н фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 8,65 г (0,05 моль) гидрохлорид тирамина

1и перемешивают при 0 С в течение

1 ч. Продукт отфильтровывают, промы. вают водой, ацетоном и сушат на воздухе. Содержание продукта

0,45 ммоль/г.

Пример 10. Иммобилиэация нуклеозидфосфатов (кофермент) 10 r -аминобензамидозтилцеллюлозы обрабатывают нитритом натрия, как указано в примере 9, суспендируют в

250 мл холодного (О C) 0,1 и фос фатного буфера. рН 8,0, содержащего

3,91 r (0,01 моль) аденозин-5-мо, нофосфорной кислоты динатриевой со:ли и перемешивают при 0 С в течение

1 ч. Продукт отфильтровывают, промывают водой, ацетоном и сушат на воздухе. Содержание продукта 0,30 ммоль/г,, Температура взаимодействия л-нитробензоилазида с аминоэтилцеллюлозой, С 20

Время взаимодействия и -нитробензоилазида с аминоэтилцеллюлозой, ч 5

Время восстановления нитрогруппы дитионитом натрия, ч Температура восстановления нитрогруппы дитионитом натрия, С 50

Степень замещения конечного продукта, ммоль/г

Пример 11. Иммобилизация

3,4-диметокси-в-фенилэтиламина (ингибитор фермента). 10 г л -аминобенэамидоэтилцеллюлозы обрабатывают нитритом натрия по примеру 9 и суспендируют в 250 мл холодного (О С) 0,1 н фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 1,81 г (0,01 моль) 3,4-диметокси-р-фенилэтиламина и пере4 мешивают при 0 С в течение 1 ч.Продукт отфильтровывают, промывают водой, этанолом и сушат на воздухе.

Степень превращения, судя по цветному тесту, с тринитробенэолсульфонатом натрия является количественной.

Полученные сорбенты обладают повышенной сорбционной емкостью по отношению к биологически активныщ ве- ществам,содержащей 300-450 мкмоль/г по сравнению с сорбентом по способупрототипу, у которого емкость составляет 0,5-5 мкмоль/г. Кроме того, применение новых модифицирующих агентов, обеспечивающих введение

П-аминобенэоильного остатка, позволяет получить сорбент для иммобилизации целого ряда биологически активных веществ, таких как субстраты ферментов, ингибиторы ферментов, коферменты и другие, которые невозможно иммобилизовать сорбентом,полученным по известному способу.При этом сохраняются все преимущества целлюлозного носителя. Применение новых модифицирующих агентов исключает использование высокотоксичных веществ, таких как сероуглерод и изобутилхлорформиат, являющихся в прототипе одними из компонентов реакционной смеси.