Способ сохранения генофонда сортов и видов картофеля

Способ сохранения генофонда сортов и видов картофеля

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА СОРТОВ И ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ , включающий предварительное культивирование меристематических верхушек на питательной среде, охлаждение объекта в ампулах в присутствии криопротектора , затравку кристаллизации, последующее замораживание и хранение в жидком азоте, отличающийся тем, что, с целью сохранения высокого уровня жизнеспособности меристем и упрощения способа криоконсервации, меристематические верхушки для охлаждения помещают в верхнюю часть ампулы, разделенной проницаемой поперечной перегородкой , а затравку кристаллизации производят путем помещения нижней части ампул в жидкий азот до начала образования кристаллов. (О 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, (Л что затравку производят в течение 1,0+0,3с.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ÄÄSUÄÄ 1055437

g(gt) А Ol Н 1/04; С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3499707/30-15 (22) 1 i.10.82 (46) 23.11.83. Бюл. № 43 (72) А. В. Манжулин, А. С. Попов и P. Г. Бутенко (71) Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева (53) 631.52(088.8) (56) 1. Bajaj VPS, Reganeration of plants

from potato meristems freeze — preserved

for 24 months, Euphytica, 1981, ч. 30, № 1, р. 141.

2. Towill L. S. Solanum etubегоsum; à model for studying the cryobiology of shootstips in the tuber-bearing Solanum species.

Plant Science Letters, 1981. ъ. 20, № 4, р. 315. (54) (57) 1. СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА СОРТОВ И ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ, включающий предварительное культивирование меристематических верхушек на питательной среде, охлаждение объекта в ампулах в присутствии криопротектора, затравку кристаллизации, последующее замораживание и хранение в жидком азоте, отличающийся тем, что, с целью сохранения высокого уровня жизнеспособности меристем и упрощения способа криоконсервации, меристематические верхушки для охлаждения помещают в верхнюю часть ампулы, разделенной проницаемой поперечной перегородкой, а затравку кристаллизации производят путем помещения нижней части ампул в жидкий азот до начала образования кристаллов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что затравку производят в течение 1,0+ 0,3 с.

1055437

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам низкотемпературного хранения тканей и клеток растений, и может быть использовано в селекции и семеноводстве для длительного сохранения генофонда картофеля.

Известен способ сохранения генофонда картофеля, основанный на глубоком замораживании меристематических верхушек.

Меристематические верхушки, после предварительного культивирования на жидкой питательной среде в течение 3-5 сут и последующей инкубации на среде с криопротекторами в течение 1 ч быстро погружают на кончиках стерильных игл или в пластмассовых ампулах прямо в жидкий азот.

Этот способ позволяет сохранить жизнеспособность меристематических верхушек в пределах от 27% до 76 % для культурного и для дикого видов соответственно (1).

15

Недостатком этого способа является сильное варьирование по уровню жизнеспособности между замороженными образцами после оттаивания.

Известен та кже способ криоконсервации меристематических верхушек картофеля после предварительной подготовки по аналогии с указанными способами, отличительной чертой которого является медленное охлаждение апексов в присутствии криопротектора со скоростью 0,3 С/мин до

40 С с последующим быстрым погружением в жидкий азот . В этом способе в ходе замораживания производят затравку (искусственную инициацию кристаллизации) раствора криопротектора путем внесения кусочка льда в ампулу с помощью микропипетки при температуре — 5 С. Такой способ позволяет сохранить жизнеспособность апексов на уровне 71% после криоконсервации (2).

Однако способ имеет ряд недостатков.

После предварительной подготовки ампулы с меристематическими верхушками помещают в спиртовой раствор с температурой

5 С и через 10 мин производят затравку кристаллизации. Для этого в стерильных условиях в каждую ампулу по отдельности вносят кусочек льда с помощью микропипетки, и через 10 мин медленно (примерно

0,3 С/мин) снижают температуру спиртового раствора с помогцью системы сосудов

Дьюара, охлаждаемой жидким азотом. При значительном количестве ампул такой способ усложняет и удлиняет весь процесс замораживания. Кроме того, не исключается возможность инфицирования меристематических верхушек в процессе затравки.

Таким образом, известный способ криоконсервации является громоздким и трудоемким, так как требует стерильных условий при замораживании и проведении ряда дополнительных операций.

Целью изобретения является сохранение высокого уровня жизнеспособности меристематических верхушек картофеля в процессе медленного замораживания и последующего хранения в жидком азоте, а также упрощейие способа криоконсервации.

Поставленная цель:достигается тем, что перед замораживанием меристематические верхушки помещают в раствор криопротектора в верхнюю часть ампулы, разделенной поперечной перегородкой с отверстиями, которая предотвращает непосредственное повреждение меристематической ткани в момент затравки, процесс охлаждения ведут в программном замораживателе, а затравку раствора криопротектора, находящегося в нижней части ампулы под перегородкой, производят путем одновременного погружения дна всех ампул в жидкий азот до начала образования кристаллов.

При этом затравку производят в течение 1,0+ +0,3 с. Температуру в камере аппарата поддерживают неизменной до момента образования кристаллов льда во всем объеме раствора криопротектора. Тем самым обеспечивается медленная дегидратация меристематической ткани, что в свою очередь препятствует кристаллизации воды внутри клеток.

Пример. Для замораживания используют меристематические верхушки культурного тетраплоидного вида картофеля сорта

«Домодедовский». Предварительная подготовка апексов заключается в культивировании их на жидкой питательной среде с

5О/О ДМСО (диметилсульфоксид) в течение

24 ч. Размер апексов 250-500 мкм. Условия культивирования: температура 26 С, освещенность 5000 лк, постоянный свет, влажность 70%. После предварительной подготовки меристематические верхушки переносят в 1,0мл 5%-ного раствора ДМСО в питательной среде в ампулы с поперечной перегородкой, плотно прилегаюшей к стенкам и разделяющей весь объем раствора

ДМСО на две равные части, сообшающиеся между собой через два отверстия диаметром 0,2 мм в поперечной перегородке.

Таким образом, замораживаемый объект отделен от зоны образования и первоначального быстрого роста кристаллов льда, происходяшего в момент затравки. Меристематические верхушки охлаждают в программном замораживателе со скоростью 0,5 С мин. При температуре - 5 С производят затравку сразу всех ампул, находящихся в специальном штативе, путем погружения их дна в жидкий азот на 1,0 с. После этого температуру в камере замораживания поддерживают на уровне - 5 С в течение 20 мин, а затем продолжают охлаждение замораживаемого объекта с первоначальной скоростью до - 40 С, после чего сразу погружают в жидкий азот (- 196 С). После хранения в жидком азоте ампулы быстро размо1055437

Способ затравки

Средний уровень жизнеспособности меристематических верхушек после до замораживания (контроль), замораживгн ия (хранения,оттаива— ния), Ъ

Внесение кусочков льда в ампулы с помощью микропипетки в стерильных условиях х

71,0

96,0

Погружение дна ампул с поперечной перегородкой в жидкий азот на 1,0 с

95,0

84,0

Данные взяты из работы Тоуилла (2).

Составитель С. Куваева

Редактор А. Шишкина Техред И. Верес Корректор О. Тигор

Заказ 9179/5 Тираж 721 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, ж — 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент>, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 раживают в воде при 40 С, и меристематические верхушки высаживают на агаризованную среду. Условия рекультивировайия такие же, как и при предварительной подготовке материала к замораживанию. Жизнеспособность апексов после оттаивания определяют путем подсчета количества развивающихся меристематических верхушек после рекультивирования на питательной среде в течение 7-10 дней. Уровень жизнеспособности меристематических верхушек в зависимости от способа криоконсервирования показан в таблице.

Предлагаемый способ позволяет увеличить средний уровень жизнеспособности меристематических верхушек на 13 /o no сравнению с известным способом, а также

5 является менее трудоемким, так как значительно упрощает и сокращает процесс замораживания за счет исключения из него всех операций, необходимых для проведения затравки раствори криопротектора в стерильных условиях путем внесения ку10 сочка льда в него с помощью микропипетки.