Способ получения иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса

Способ получения иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ПОЛУЧгаМЯ ИГОЮБИЛИЭОВАННОГО ГБЮЩЕЯЛЮЛАЗНОГО КЭМПЛЕКСА путед4 ковгшентного связывания ферментного препарата с HepacitBOpHhAM носнтеле, о т л я ч а ю ц и и с я тем/ что, с целью повышения выхода целевого продукта и комплексного использования исходного сырья, и польч зупт ферментный препарат AsperglCtuS higer 15, содержащий ксиланазу,арабиигиэу , галАктаназу и маннаназу, а в качестве носителя используют бензохйноновый силохром при соот- .:НОй1еиии носитель:фермент - lt

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

ВН Я ВП °

РЕСГ)УБЛИН (1В . till

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН и АВТОРСКОМУ СВИДВТВЪСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbITIO (21) 3476167/28-13 (22) 23.07 ° 82 (46) 23.11 ° 83. Бвл В 43 (72) Д.Ю. Балцере, А.К. Арен, .

А.М. Безбородов, И.М. Тавобилов, Н.Я. Родионова, И.М.-В. Горбачева и О.И. Игнатьева (53) 577 ° 15(088.8) (56) 1. Патент (ЮА.В 4275159, С 12 И 11/1&, С:12 N 9/14 " 1981а

2. Pauper 3i, Sinner М., Dietrichs Н. Untersuchungen,: ц ber trLgergebundene Xytanasen. - HoLzforschung, 1974, В 28 В 3, S. 106-113.

ЗСЮ С 12 N 9/24у С 12 И 11/14 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИ:путем ковалентного связывания фериентного препарата с нераст вориьим носителем, о т л и ч а в ц н и с я тем, что„с целью повыаения выхода целевого продукта и комплексного ис-. .пользования исходного сырь я, иеполь зувт Ферментный препарат Aspergi6tus

niger 15, содериащий ксиланаэу,- арабиназу, галактаиаэу и маннаназу, а в качестве носителя использувт бензояиноновый силохром при соот-нсхяении.носитель!фермент - lt(0,02„ 0,03), причем процесс проводят в

;0,1 М ацетатиом буфере при рН 4,05 0 °

1055770

Изобретение относится к получению иммобилиэованных Ферментов, например гемицеллюлазного комплекса.

Гемицеллюлазы используются при гидролиз е геми целлюлоз ны:г > компонентов растительной ткани., Продукты гидролиза являются исходным сырьем для производства фурфурола, этилового спирта, кормоных дрожжей, кристаллической ксилозы, триоксиглутаровой кислоты, пятиатомного спирта 1О ксилита,,метилглиоксаля, эритроновой и глицериновой кислоты, глицерина, гликоля, пропиленгликоля и целого ряда органических соединений.

Иммобилиэация гемицеллюлазы обеспе- 15 чивает создание более эффективных гидролиэующих аг"ентов.

Известен способ иммобилизации ксиланазы совместно с В-ксилозидазой и Ферментом, разрушающим урановые кислоты, на пористом стекле с no" мощью глутароного альдегида $1) .

Недостатком способа является низкий выход иммобилизованной ксиланазы - 10%. 25

Наиболее близкнм к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса путем ковалентного снязынания ферментного препарата с нерастворимым носителем„ в качестве которого,используют сополимер ангидрида малеиноной.кислоты и бутандиолдивинилэфира в среде 0,05 N фосфатного, г буФера, рН 7, при соотношении носитель:Фермент lг0,5. Связывается

50% от взятого количества белка..

Ксиланаэная активность полученного иммобилизованного препарата 58-59% от исходной активности (2 . 40

Недостатками способа являются большие потери фермента, так как ковалентное снязывание фермента с носителем осуществляется через ангидридные группы, которые крайне неустойчивы в водных растворах, а также низкий выход по активности (58-59% от исходной).

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта и комплексное использование исходного сырья.

Поставленная цель достигается предлагаемым способом получения иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса, заключающимся s ковалеитном связывании ферментного препарата 55 с нерастворимым носителем, с использованием ферментного препарата Asperд1Фив niger 15 содержащего ксиланаэу, арабиназу, галактанаэу и маннаназу, причем в качестве носителя 60 используют бензохиноновый силохром при соотношении носительгфермент

l г(0,02 - 0,03) и процесс проводят в 0,1 И ацетатном буфере при рН 4,0 5,0. 65

Для иммобилизации используют тех ° нологнческий препарат Asp. niger содержащий 4 фермента с достаточно высокой активностью.

Иммобилизация предлагаемым способом обеспечивает сохранение всех

4 ферментных активностей, кроме того, по отношению к арабиназной, галактанаэной и манианазной активностям наблюдается повышение активности за счет очистки препарата в процессе иммобилизации.

Есиланаэа иммобилиэуется с сохранением 893 активности от исходной (по 4-0-метилглюкуроноксилану), арабиназа - с сохранением 113% активности от исходной (по арабинану), галактаназа - с сохранением 114% активности от исходной (по галактану), маннаназа - с сохранением 142% актив» ности от исходной (по галактоманнану) .

Силохром, активированный П -бензохиноном, является злектронноакцепторным соединением и легко вступает в реакции с нуклеофильными реагентами, Схема реакции следующаяг

О

lt (:Силохром ->yH +юг-гемицеллюлаэаг; Н

НЛ -гемицеллюлаза силохром-ИН

IT

В результате высокой реакционноспособности хинонов реакция ковалентного связывания фермента с носителем происходит быстро и с небольшими потерями фермента.

Продолжительность реакции связывания 2 ч. Связывается до 80% от взятого количества белка.

Hh данном носителе хорошо иммобилиэуются все компоненты гемицеллюлазного комплекса. Условия иммобилизации и свойства носителя обеспечивают сохранение высоких активностей иммобилиэованного препарата.

Связывание большей, чем балластных белков, части белков-ферментов .обеспечивает повышенную активность иммобилизованного гемнцеллюлаэного комплекса по сравнению с соответствующими активностями в исходном препарате.

Способ осуществляют следующим образом.

При контактировании раствора Ферментного препарата Asp. niger 15 с бензохиноновым силохромом при весовых соотношениях носитель:фермент.= lã(0,02 — 0,03) в среде 0,1 И аце- татного буфера (рН 4-5) получают им1055770 мобилизованный ферментный препарат 1 с ксиланазной активностью не менее

89% от исходнойг арабиноэидаэной113%, галактозйдаэной — 114%, маннозидазной - 142% от исходной активности»

В результате имеет место более комплексное использование исходного сырья.

Пример 1. К 0,5 г бензохиноинового силохрома прибавляют раствор 0,05 г ферментного препарата гемицеллюлазы в 2. мя 0,1 М ацетатного буфера, рН -4,6. Весовое соотношение носительгбелок=lг0,02 ° Используют геммицеллюлазный препарат из

Аэрегд1И us niger 15 с. содержанием белка 20% и ксиланазной активностью

0,985 ед/мг белка, арабиназной - .

0,194 ед/мг. белка, галактаназной -

0,081 ед/мг белка, гланнаназной0,026 ед/мг белка.

Выдерживают 2 ч при 20ОС и отфильтровывают. Промывают 3 ° 10 мл 1 М раствора NaC5 и 2 5 мл ацетатного : буфера.

Полученный препарат иммобилизованной гемицеллюлаэы содержит 16 мг белка на r носителя (80%.выход по белку) .

Активность препарата г ксиланаэная — 0,880 ед/мг белка .(89,3% от исходной)г арабинаэная — 0,220 ед/мг белка (113,4% от исходной); галактаназная - 0,093 ед/мг белка (1.14.,8% от йсходной),маннаназная - 0,037 ед/мг белка (142, 33 от исходной) .

Пример 2. К 2 г бенэохиноинового силохрома прибавляют раствор

0,30 г ферментного препарата гемицеллюлаэы иэ Азрегд1Иггв niger 15 в

8 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,0.

Отношение носитель: белок 1:0,03.

Выдерживают 2 ч при 20 Си отфильт-, ровывают. Промывают 3 ° 30. мл .1 М раствора NaC8 и 2 15 мл ацетатного буфера. Полученный препарат иммобилизованной гемицеллюлазы содержит

24 мг белка на г носителя (80% выхода) .

Активность иммобилиэованной гемицеллюлазыг ксиланаэная - 0,883 ед/м белка (89,7% от исходной)г арабинаэная — 0,221 ед/мг белка (113,9% от исходной) 1 галактаназная0,092 ед/мг белка (114,93 от исходной) 1 маннаназная — 0,037 ед/мг белка (142,7% от исходной) .

Пример 3. К 1 г бензохиноин нового силохрома прибавляют раствор

0,125 г Ферментного препарата гемицеллюлазн: из АэрегдИВиз niger 15 в 4 мп 0,1 М ацетатного буфера рН 4

:(отношение lг0,025) .

Выдерживают 2 ч при 20ОС и отфильтровывают. Промывают 3 » 15 мл 1 М; раствора NaCE и 2 10 мгг ацетатного буфера.

Полученный препарат иммобилиэованной гемицеллюлазы содержит 20 мг белка на г носителя (выход 80%).

Активность иммобилизованной гемнцеллюлазыг ксиланазная - 0,886 ед/мг, белка (90В от исходной)г арабиназная — 0,219 ед/мг белка (1193 от исходной),галактаназная — 0,093 ед/мг белка (115% от ггсходной); маннанаэная — 0,038 ед/мг белка (146,1%

10 от исходной .

Определение гемицеллюлазных активностей.

Ксиланазная активность.

К 5 мг 4-0-метилгггюкуропоксилана добавляют 1 мл 0,1 М ацетатного буфера,.рН 4,2. Навеска влажного иммобилизованного фермента 5 мг (содержание сухих веществ 30%) ° Инкубация

30 мин при 40 С. Реакцию останавливают 15-минутным кипянением на водяной бане. Редуцирующие сахара определяют по методу Сомоги-Нельсона.

Арабинаэная активность.

К 5 мг арабннана добавляют 1 мл

О,l ацетатного буфера, рН 4,2. Навеска иммобилизованного фермента

;5 мг. Инкубация 30 мин при 40 С. Реакцию останавливают 15-минутным ки пячением на водяной бане. Редуцнрую" щие сахара определяют по методу Сомоги-Нельсона.

Галактаназная активность.

К 5 мг галактана (из белого люцина) добавляют 1 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,2 ° Навеска иммобилизо35 ванного фермента 5 мг. Инкубация

30 мин при-40 С. Реакцию останавливают 15-минутным кипячением на родя-, ной бане. Редуцирукщне. сахара определяют по методу Сомоги-Нельсона.

40 Маннаназная активность»

К 5 мг галактоманнана (из семян люцерны) добавляют 1 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,2. Навеска иммобилизованного фермента 5 мг, 45 Инкубация 30 мин при 40 С. Реакцию останавливают 15-минутным кипячение(» на водяной бане. Редуцирующие сахара определяют по методу Сомоги-Нельсона..

3а единицу активности принимают такое количество фермента, которое каталиэирует образование 1 мкмоль эквивалента ксилоэы за 1 мий при данных условиях.

Технико-экономический эффект предлагаемого изобретения заключается в экономии и комплексном использовании ферментного препарата, т.е. в связывании четырех компонентов с вы соким выходом, а также в повьиаении

60 выхода ксилонаэы.

Высокие показатели всех актиггнос»» тей иммобилизованной гемицеллюлаэм являются предпосылкой практического использования иммобилизованного

65 "ре"арата

1055Па

Составитель В. Муронец

Редактор Н. Егорова Техред N.Tenep Корректор A. Эимокосов

Тираж 523 Подписное

° ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5.Эаказ 9241/22

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Иммобилизованный препарат гемицеллюлазы можно применять для осахаривания растительных отходов, в частности для осахаривания водорастворимых олигосахаридов - отходов про изводства целлюлозы, с получением ксилоэы, арабинозы и маннозы. Эти моносахариды в дальнейшем могут быть использованы в качестве источника ,углеводородов для выращивания кормовых дрожжей, в микробиологической промышленности. Ксилоза легко может быть превращена в ксилит и фурфурол, широко применяемые в фармацевтической и химической промышленнос ти.