Способ получения иммобилизованного трипсина

Способ получения иммобилизованного трипсина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОВИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИНА, предусматривающий связывание трипсина с сывороточньв4 альбумином с помощью глутаро- . Вого альдегида, о т л и ч а ю ut -и йс я тем, что, с целью повьшения устойчивести получаемого продукта к тканевым ингибиторам и ингибиторам крови, сывороточный альбуминиспользуют в форме частиц геля и процесс ведут при путем обработки гелевых частиц глутаровым альдегидом с последующим связыванием с ферментом при следуюцем соотисхйении компонентов в реакциониой смеси, мас, Гель альбумина 15-20 Глутаровый альдегид 1-2 Трипсин3-5 2. Способ по п. 1, от ли ч а-ю щ и и с я тем, что -используют частицы геля на основе водной смеси, содержащей, мас.%: : Сывороточный альбумин 4-5 Глицерин2-3 Глутаровый альдегид 2-3

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

09) (1И

1(51) С 12 N 9/76; С 12 М 1.1/06

/ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ CCCP

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ::/ 7 л.

H ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3353749/28-15 (22) 07.09.81

:(46) 23.11.83 ° Бюл. 9 43 . (72) К.H. Веремеенко, E.Ã. Судьина, В.Д. Сеиичаевский и Г.Ф. Карпенко (71) Киевский научно-исследовательский институт отолариигологии нм. A„H, Коломийченко и Институт

° ботаники.им. Н.Г. Холодного (53) 577 15.07(088 ° 8) . (56) 1. Березин И.В. и др. Иммобилк;зованные ферменты. М. изд . ИГУ, 1976 т l,с, 165

2. БогачеваТ.И.,Миргородская О.А,, Москвичев Б.В. Некоторые особенности взаимодействия трипсина с глутаровым альдегидои в растворе. Прикладнан биохимия и микробиоло- . : гия . 1976 т. Хll, вып. 3, с. 428.431.

3. Украинский биохимический иурнал., 1955, В 1, с. 94-100.-! (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИОБИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИНА, предусматри вающий связывание трипсина с сывороточным альбумином с помощью глутаро-; аого альдегида, о т л и ч а ю щ н и с я теи, что, с целью повыяення устойчивости получаемого продукта к тканевым ингибиторам.н ингнбиторам крови, сывороточный альбуиин используют в форме частиц геля н процесс ведут при 4-10 С путем обработки гелевых частиц глутаровым альдегидом с последующим связыванием с ферментом прк следующем соотношении компонентов в реакционной смеси, иас,В

Гель альбуиина 15-20

Глутаровый альдегид 1-2

Трипсин 3-5

2. Способ по и. 1, о т л н ч,а ю.шийся тем, что .иопольэуют частицы геля на основе водной смеси, содержащей, мас.В:

Сывороточный альбуикн 4-5

Глицерин 2-3

Глутаровый альдегид 2-3 . Ф

10557 71

4,5

2,3

2,3

До 100

Изобретение относится к медицинской энзимологии, а конкретнее к протеолитическим ферментам медицинского назиачения, и может быть использовано при лечении гнойно-воспалительных процессов„ например в отоларинголо-. гии, стоматологии, при лечении ожогов, гнойных ран и т.д.

Известны способы иммобилизации и стабилизации протеаз, в частности трипсина, включающие их связывание с различными носителями, что позволяет повысить их устойчивость к дей ствию теМпературы, РН, денатирующих агентов, к действию ферментов микроорганизмов, ингибиторов, к автолизу и т.д, (1) .

Медицинское применение иммобилизованных ферментов выдвигает специфические требования к свойствам материалов, используемых в качестве носителей ферментов, в частности отсутствие канцерогенных и токсических свойств, слабая антигенность, устойчивость к действию ряда ферментов и др. Этим требованиям биосовместимости в наибольшей степени отвечают носители белковой природы, например сывороточный альбумин.

Известен способ получения иммобилизованного трипсина с использованием сывороточного альбумина человека, который заключается в связывании фермента с молекулами альбумина в растворенном состоянии, причем фермент предварительно обрабатывают глутаровым альдегидом. Процесс ведут при 22 С при следующих концентрациях компонентов в реакционн6й смеси, мг/мл: трипсин 0,5; глутаровый альдегид 0,25-0,4; сывороточный альбумин

10, .При этом поскучают растворимые ассоциаты трипсина с сывороточным альбумином с молекулярной массой до

1 106 (2) .

Однако продукт, получаемый этим способом, проявляет недостаточную устойчивость к тканевым ингибиторам и ингибиторам крови (13-53% - при концентрации сыворотки крови 0,1 мл на 1 мл реакционной смеси).

Целью изобретения является повышение устойчивости иммобилизованного трипсина к тканевым ингибиторам и ингибиторам крови.

Указанная цель достигается предлагаемым способом получения иммобилизованного трипсина, предусматривающим связывание фермента с сывороточным альбумином с помощью глутарового альдегида, причем сывороточный альбумин используют в форме час" тиц геля, а процесс ведут при 4-10 С

О путем обработки гелевых частиц глу,таровым альдегидом с последующим связыванием с ферментом при следующем соотношении компонецтов в реакционной смеси, мас.Ъ: гель альбумика 15-20; глутаровый альдегид 1-2; трипсин 3-5.

Обычно используют частицы геля на основе водной смеси, coäåðæàùåé мас,%: сывороточный альбумин 4-5; глицерин 2-3; глутаровый альдегид

2-3.

В результате трипсин связывается с твердыми частицами альбуминового геля. Получают не растворимое в воде

10 производное трипсина.

Конформационная стабильность молекул трипсина, фиксированных путем многоточечного закрепления на сетчатой структуре альбуминового геля, 15 оказывается выше, чем в растворимых ассоциатах с лабильной конформацией по.известному способу. Кроме того, при многоточечной фиксации на сетчатой структуре геля эффективно блокируются центры молекул трипсина, ответственные эа взаимодействие с ингибиторами, В результате остаточная активность иммобилизованного трипсина пос-

)5 ле действия соевого ингибитора в концентрации 0,1 мг/мл составляет

60%, а после действия сыворотки крови в концентрации 0,4 мл на 1 мл смеси — 97%.

Используемые по Предлагаемому способу в качестве носителя частицы геля сывороточного альбумина получают путем нагревания .на кипящей во" дяной бане в течение 15-20 мин водной смеси, содержащей, мас.%г сывороточный альбумин человека 4-5; глицерин 2-3„ глутаровый альдегид

2-3; вода — до 100, с последующим измельчением„ Указанный интервал времени нагрева достаточен для пере-

40 вода раствора альбумина в гель при минимальных затратах тепловой энергии. Такое соотношение ингредиентов подобрано, исходя из требований получения механически прочного геля

45 при минимальном расходе сывороточного альбумина.

Соотношение ингредиентов при иммобилизации Установлено экспериментально из зависимостей активности

Щ нерастворимой формы трипсина от со,отношения фермент — носитель.

Указанные ингредиенты вводятся в последовательности: вода, гель сывороточного альбумина человека, 1 глутаровый альдегид, трипсин.

Пример. Гель сывороточного альбумина человека получают путем нагревания на кипящей водяной бане в течение 15 мин смеси, содержащей, мас.9г:.

Сывороточный альбумин человека

Глутаровый альдегид

Глицерин

Вода

1055771

Ингибитор Концентрация ингибитора, .

Остаточная активность фермента, В от исходной мг/мл

Иммобилиэованный Растворимый фермент фермент

Ингибитор трипсина из бобов сои

0,1

50

0,1

КонтриКал

Пантрипин

0,1

70 а

Овомукоид

0,4 мг на

1 мл смеси

Сыворотка крови

Составитель О. Скородумова

Редактор Н, Егорова Техред Л.Бабинец . Корректор А. Зимокосов

Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 9241/22

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

На практике, например для внутриполостного введения больному, ферментный препарат часто удобно использовать в виде. водной суспензии.

Поэтому образовавшийся гель после охлаждения продавливают через сито с диаметром пор 250 мкм, а затем отсеивают частицы с размерами менее

50 мкм, используя сито с соответствующим диаметром пор. В результате получают фракцию частиц геля с размерами пор 50 - 250 мкм, которую многократно. промывают дистиллированной водой.

Иммобилиэацию трипсина на частицах геля сывороточного альбумина проводят в водной среде при соотношении ингредиентов, мас.%s

Трипсин 3,6

Гель сывороточного аль бумина человека 18, 9

Глутаровый альдегид 1,9

Вода До 100

Указанную смесь инкубируют при

4 С на протяжении 1 ч. После инкубацйи гель с иммобилиэованным трипсином многократно промывают дйстиллированной водой, контролируя наличие белйа в растворе по поглощению при длине волны 280 нм в промывных водах. Активность иммобилизованного и растворимого трипсина измеряют по .Кунитцу в модификации М.П, Черникова„ (3, при этом в качестве субстрата используют казеин ° Влияние инги- биторов на казеинолитическую активность.трипсина исследуют в опытах, в которых ферментный препарат и ингибитор инкубируют в течение

15 мин при 20ОС. При этом сравнивают показатели для водорастворимого трипсина и имаобилизованного препарата в виде водкой суспензии.

Полученные результаты представле10 ны в таблице, из которой становится очевидным, что иммобилизованный на частицах геля сывороточного альбумина человека трипсин значительно ус.-ойчивее к действию ингибиторов тка15 ней и крови,чем растворимый.

Использование изобретения позво-. лит получать препараты трипсина с повышеннЬй устойчивостью к тканевым ингибиторам и ингибиторам крови, что даст воэможность достигнуть эффекта пролонгирования действия препарата при его применении в терапии гнойно-воспалительных процессов и эа счет уменьшения числа повторных введений препарата больным уменьшить степень травмирования тканей больного, снизить затраты на лекарственные

:препараты при лечении (экономйя фермента, обезболивающих и .антйсептических средств и т.д.), а также снизить затраты труда и времени обслуживающего персонала. (