Способ получения иммобилизованной дрожжевой алкогольдегидрогеназы

Патент 1057535

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДРОЖЖЕВСЛ АЛКОГОЛЬ/ШГИДРОГЕНАЗЫ путем ее ацсорбг ник на окиси алюминияпрв рН 8,Ou9,O с поспеаующей о лботксЛ конаенснруюшим pf агентом , отпнчаюшийся тем, что, с цепью увеличения стабильности фе{ ментного препарата, ацссфбишо провооят на Of-или аяюмииия. 2. Способ по п. 1, о т я и ч а юш и и с я тем, что в качестве кондеисируюшёго реагента используют гпутаровый альдегид в коноентрацин О,1% или ка{ бсдаимнп в кояиентрации 2,5%. сл

СОЮЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСГ1УБЛИН

„„SU„„1057535

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪ9 (21) 3410714/28-13 (22) 19.03.82 (46) 30.11.83. Бюп. № 44 (72) Г. А. Ковапенко, В. Д. Сокопов кий и Н. Б. Шитова (71) Орцена Труцового Красного Знамени институт катапиза Сибирского отцепения АН СССР

Ъ (53) 577. 15.07 (088.8) (56) 1. Микепьсоне 3. В., Митрофанова А. Н., Попторак О. М., Арен А. К.

Ацсорбционная иммобнпизация апкогопьцегицрогеназы на сипикагепе и сипокроме, моцифицированном апьбумином.вЂ” (1979) Вестник МГУ. Сер. Химия", т. 19, № 2, с. 109-113.

2. Aizawa M., Coughl in R.W., Charles М. Activation of alumina with

bovin serum Albumin аког immobolizing enzymes /1975/ Biotechnol. Bioeng, v. 17, Р 9, 136",-1372 (поототип).

Зсю С 12 If 11/14 С 12 И 9/04 (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДРОЖЖЕВОЙ АЛКО

ГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ путем ее ацсорбции на окиси апюыииияцри рН 8,09,0 с поспецующей обработкой коиценсирующим реегентом, о т п и ч а ю шийся тем, что, с цепью увепичения стабипьности ферментного препарата, ацсорбцию провоцят

Hs 6.- ипи -окисях апюминия.

2. Способ по ц. 1, о т а и ч а.юшийся тем, что в качестве конденси» рующаго реагента испопьэуют гпутаровый апьдегид в концентрации 0,1% ипи карбодимиц s концентрации 2,5%.

57535

4 10

Изобретение относится к способам иммобипизации ферментов, к частности кпопучениюгетерогеннык катапизаторов на неорганических носитепях.

Известен способ попучения иммобипизованной апкогопьпегипрогеназы {АДГ) путем ее ацсорбпии нв широкопористом сипикагепе, моцифипированном впьбуми ном flj

Оцнако панный способ не обеспечивает высокой стабипьности иммобипизованной апкогопьпегипрогеназы.

Наибопее бпизок к прецпагаемому по технической сущности и постигаемому попожитепьному эффекту способ получения иммобипизованной црожжевой апкогопьцегипрогеназы путем ее апсорбции на й; - окиси апюминия при рН 8,0-9,0

: поспецующей обработкой конценсирующим реагентом - например гпутаровым апьцеги- i цом f2)

Иммобипизацию фермента цровопят на ф. -окиси алюминия типа 5АЕН5ЗЭ нз вопных растворов при 25 С. ПвО раметры сорбента » уцепьная поверхность 4 м /г,срепний пиаметр пор 1000 3.

Размер пор носите пя не соответствует размеру мо пеку пы фермента. . Спеповатепьно, в порак этого носителя не происхопит многоточечного связывания фермента вспепствие отсутствия так называемого станочного эффекта. Поверхность Ж -окиси апюминия характеризуется напичием спабых киспотно-основных центров, которые связывают фермент, и низкой ик концентрацией. Поэтому иммобипизованная на таком носитепе апкогольпегицрогенаэа имеет низкую стабипьность. Обработка гпутаровым впьпегипом не привоцит к эначитепьному увепичению стабипьности препарата. Активность препарата 3-5 ЕА/r, время попкой пезактивапии от 6 по 7 дн.

Непостатком известного способа явпяется низкая.ствбипьность препарата иммобипизованного фермента.

l1ear изобретения - увепичение стабипьности ферментиого препарата, Указанная цепь постигается тем, что согпвсно способу попучения иммобипизо ванной прожжевой . апкогопьпегипрогена зы путем ее впсорбции на окиси апюм ния при рН 8,0-9,0 с поспепующей об.работкой коиценсирующим реагентом ацсорбцию провопят нв 9 -ипи g -оки« сяк впюмииия.

Обычно в качестве конценсирующего ревгентв испопьзуют гпутарбвый впьпв5

50 гип в концентрации 0,1% ипи карбоциимиц в концентрации 2,5%.

Низкотемпературные формы окиси апюминия 8, g обпаааают, во-первых оптимапьной пористой структурой, во-вторых, цостаточной концентрацией и сипой киспотно-основных центров на поверкности. Допопнитепьное увепичэние стабипьности постигается обработкой ацсорбированного фермента конпенсирующими агентами (гпутаровым апьпегипом, карбопиимипом).

Испопьзованный в способе носитепьокись апюминия, явпяется крупнотоннажным промышпенным пропуктом, аешевым и цоступным. Этот носитепь имеет пегко регупируемую пористую структуру, что явпяется черезвычайно важным цпя иммобипизвпии ферментов.

Преппагаемый способ эакпючается в спепуюшем.

Навеску носитепя (25 мг) пезаэрируют, BElllHBsIQT 2 мп буферного pBGTBops фермента и провопят апсорбпию фермента при комнатной температуре цо пости- жения апсорбпионного равновесия (2 сут).

По разности копичеств АДГ в исхопном и равновесном растворе рассчитывают копичесJ. во впсорбированного фермента.

Затем апсорбированную впкогопьпегипрогеназу обрабатывают 0,1% гпутаровым апьцегицом (О, 1%) ипи карбопиимипом в концентрации 2,5 % в течение 30 мин. при комнатной температуре.

Активность иммобипизованного фермента измеряют в пиркупяционной установке с пифференциапьным безграпиентным реактором, термостатируемым при 25 С. Скорость ферментативной реакции опрепепяют спектрофотометрически по появпению

ЙА© Н, имеющего попосу погпощения при 340 нм.

Стабипьность иммобипизованной апкогопьпегицрогенаэы опрецепяют при кранении в буферном растворе при комнатной темцерм уре, периопически испытывая попученный образец на активность. Потеря л 95% первоначапьной активности считается полной цеэактиввцией иммобипизованной ALII .

П в и м е р 1. Иммобипизвция прожжевой апкогопьпегипрогеназы нв 9 0КН си апюминия,.

Навеску ф4Я О (5щ 7 3М / пезвэри» руют и запивают 2 мп буферного раствора впкогопьпегипрогеназы (0,05 М трисбуфер, рН 8,0) в концентрации 700800 мкг ALIF/ìï. Апсофбцию провопят

1057535 при комнатной температуре в течение

2 сут.

Максима льнач в е личина а цсорбции постигает 45 мг/г. Активность полученного образца 30 ециниц активности на г 5 препарата (за ецинипу активности (EA) фермента принимают такое его количество, которое восстанавливает 1 ммоль

NA О /мин при 25 С (рН = 8,0) и насыщающих концентрапияк этанола).

При хранении полученной иммобили1 зованной алкогольцегицрогеназы в буферных растворак (0605 М трис-буфер, рН 8,0) и комнатной температуре фермент полностью цезактивируется за 5 не- 5 цепь.

Пример 2. Иммобилизапия црожжевой алкоголькегицрогеназы на -окиси алюминия.

Ацсорбцию фермента нар4Щ(»щ0„, 20 провоцят в условияк примера 1.

Величина ацсорбции цостигает 46мг/г, активность - 20 ЕА/r препарата. Алкогольцегицрогеназа, ацсорбированная на таком носителе, поцностью теряет свою активность за 5 нецель хранения в триобуфере (рН 8,0) при комнатной температуре.

Алкогольцегицрогеназа, ацсорбированная на 6 =)=A(() облацает большей ста 30 бильностью по сравнению с ферментом иммобилизованным на g, »AEggq . В порах этик носителей АДГ связана наиболее прочно и многоточечно вслецствие стеночного эффекта. Ацсорбция алкогольцегицро -З5 геназы íà g u g -окисях алюминия увеличивает ее стабильность в сравнении с нативным ферментом: лри хранении в трис- буфере (рН 9) иммобилизованный фермент цезактивируется за 5 нецель, 40 нативный - за 4 цн. Наблюцается оптимум стабильности в зависимости от степени заполнения поверхности АДГ. Наиболее стабильны образцы, в которых по верхность носителя покрыта полностью, 4 4 когца межбелковые взаимоцействия молекул цруг с цругом стабилизируют фермент . алкогольцегицрогеназы. Иммобилизованная на »ЦО алкогольцегицрогеназа при хранении в пирофосфатном буфере(рН 9) и

50 комнатной температуре полностью цезакти.вируется на 4 цн. Слецовательно, . ацсорбированная на Я II" Д3 црожжевая АДГ на стабильнее.

Пример 3. Иммобилизапия алко.гопьцегицрогеназы на 8 -окиси алюминия с послецующей обработкой глутаро»вым апьцегицом, Полученную в усповияк примера 1 ацсорби рованную на 3= A3. 0 алкогольцегицрогеназа обрабатывают глутаровым альцегицом по слецующей метоцике: концентрация глутарового альцегица 0,1%, время сшивки 30 мин при комнатной температуре. Затем провоцится восстановпение образовавшихся оснований шиффа

20 мМ боргицрицом натрия в течение

20 мин, при 00С.

При хранении в 0,05 М трис-буфере (рН 8,0) с цобавлением 1 мМ ЭДТА и 1 мМ меркаптоэтанола в течение 1 мес. иммобилизованная алкогольцегицрогеназа (a = 45 мг/г) сохраняет 90-100% первоначальной активности.

Иммобилизованная алкогольцегицрогеназа, приготовленная таким способом, сохраняет 30-40% первоначальной активности по истечении 9 мес. хранения при комнатной температуре и 80-100% - при хранении в холоцильнике (50С).

Обработка глутаровым альцегицом

2 ацсорбированной íà g = Pg

= 6 м /г) алкогольцегицрогеназй привсь» я 44) цит к незначительному увеличению ста<бильности иммобилизованного фермента: обработанная глутаровым альцегицом АДГ полностью цезактивируется за 11-12 цн. тогца как без обработки этим реагентом - за 3-5 цн.

Пример 4; Ацсорбция комплекса фермент: кофермент или фермент вЂ” cy6страт на Q $3 0> с послецующей обработкой глутаровым альцегицом.

На носитель 8 -окись алюминия (5 = 73 м /r) ацсорбируют комплекс, 7 фермента с субстратом (этанолом) или коферментом (g А D ) в условиях приме ра 1, При этом активный центр фермента, в который вкоцят Й Hq -соцержащие аминокислоты, защищается ет. моцифика-, ции глутаровым альцегицом, обпацаю щим сроцством к активному центру АДГ.

Послецующую обработку комплекса my» таровым альцегицом провоцят IIo метоцике, описанной в примере 3. Поцученная таким образом, иммобипизованная апко гольцегицрогеназа (45 мгlг) полностью сохраняет свою активность по истечении

1 мес хранения при комнатной xebmepaтуре (0,05 М трис-буфер, рН 8,0;

1 мМ ЭДТА; 1 мМ меркаптоэтаноп).

Пример 5. Иммобипизапия црож жевой алкогопьцегицрогеназы с поспецующей обработкой карбоциимицом.

Ацсорбированную íà 9» Я Ц(Ь (3у д в условиях примера 1 алкогольцегицро1057535

Составитель В. Муронец

Рецактор Л. Пчепинская Техрец М.Наць

Корректор А. Ференц

Заказ 9496/3 1 Тираж 523

ВНИИПИ Госуцарственного комитета СССР по цепам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., ц. 4/5

Поцлисное

Фипиап ППП "Патент", r. Ужгороц. уп. Проектная, 4 геназу обрабатывают карбоциимицом

1 - цикпогексип-3-(2-морфопинозтип), -карбоциимицмето-4»топуопсуцьфонатом) по спецующей метоцике: 2,5%ным раствором карбоциимица (рН 8,0) сшивают мопекупы фермента цруг с цругом Ъри комнатной температуре в течение 30 мин.

Дпя уцапения карбоциимица поспе реакции образец многократно промывают бицистиппированной воцой. Бпагоцаря бопь шому размеру мопекупы, карбоциимиц почти не затрагивает активный центр фермента ь что позвопяет попучать бопее активный, чем в щ5имере 3, препарат иммобипизованной апкогопьцегицрогеназы. Активность АДГ, обработанной гпутаровым апьцегицом (пример 3), составпяет 16 ЕА/г препарата, активность сшитого карбоциимицом фермента 25 ЕА/г препарата, т. е. s 1,6 раз бопьше.

Попученная такий образом апкогопьцегицрогеназа (Cl = 25 мг/г) сохраняет в течение 1 мес хранения в тряс-буфере рН 8,0 (с 1 мМ ЭЙТА и 1 мМ меркаптоэтанолом) при комнатной температуре 95-100% первоначапьной активнооти.

Преимуществом цанного способа явпяется высокая стабипьность препаратов иммобипиеованной црожжевой апкогопьцегицрогеназы, попученных путем ацсорбцни путем ацсорбции фермента на 9,-) формах окиси апюминия с поспецующей обработкой конценсирующими агентами (гпутаровым апьцегицом, карбоциимицом), по сравнению с препаратами фермента, ацсорбированными на М окиси апюминия.

Высокая стабипьность препарата явпяется важнейшей технопогической хараК» теристикой и позвопяет испопьзовать иммобипиэованную апкогопьцегицрогеназу в проточных реакторах с максимапьной эффективностью.