Способ определения активности концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы

Способ определения активности концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

CnOCOfi ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КОНЦЕЮЙ ДЕЭОКСИНУКЛЕОТИДИЛТРАНСФБРАЗЫ , вкштчакхций инкубацию исследуемого материала с матрицейзатравкой и радиоактивно меченом нуклеозидтрифосфатом, выделение попимеризованного ргшиоактивного продукта на фильтре и ргцшометрирование целевого процукта, о т л ичаю14ийся тем, что, с целью повьаиения чувствительности способа, а также возможности осуществления способа в нативном материале в качестве затравки используют денатурированную ДНК, при этом ее вводят в инкубационную смесь в фиксированном СОСТОЯНИЙ на ДЕАЕ-фнльтре, дополнительно вводят контрольный ДЕДЕфильтр , далее ДЕЛЕ-фильтры переносят Щ в раствор иш4еченного нуклеозидтрифосфата , проводят радиометрический анализ обоих фильтров и активность фермента (этределяют по cyi«ie двух значений.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1057852 А

ЗСЮ С 12 Й 1 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

fO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н двчонснсмм сенщетвъстю

ТРАНСФЕРАЗЫ, вклпчакиций инкубацию исследуемого материала с матрицейзатравкой и радиоактивно меченыч нуклеозидтрифосфатом, выделение полимеризованного радиоактивного продукта на фильтре и радиометрнрование целевого продукта, о т л ич а ю ц и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, а также возможности осуществления способа в нативном материале в качестве затравки используют денатурированную ДНК, при этом ее вводят в инкубационную смесь в фиксированном состоянии на ДЕАЕ-фильтре, дополнительно вводят контрольный ДЕАЕфильтр, далее ДЕАЕ-фильтры переносят I в раствор немечеиного нуклеозидтрифосфата, проводят радиометрический анализ обоих фильтров и активность фермента определяют по сумеее двух значений. (21) 3438517/28-13 (22) 06.05.82 (41) 30.11.83..Нкщ.В44 (72) A.Н. Щутко, Н.Н. Шатинина и Л.С. Jly6mx (71 ) Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт (53) 612.015.1(088.8) (56) 1. Modak М.J et al А micr6method for беtermination of Фетш аа1

deoxymicleotidyl transferase in the

diagnostic е вluation of acute len

Remiss,-J ° Cancer Дев. and с1И Oncol

1980, 48, р \ 91-104.

2.0Кащига S. et al; Single-cell

immunofluorescence assay for TDT huaalu lenkemia and non-leukamic сells.—

Brit.J.Cancer 1980, 41, К2, ф.1591á 7 (прототип ) . (54 ) (57 ) CIIOCOS ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТН КОНЦЕВОЙ ДЕЭОКСИНУКЛЕОТИДИЛ1057852

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической энэимологии, н может быть использовано в экспериментальных и клинических условиях соответствующих исследовательских нли лечебных учреждений для диагностики и контроля лечения лейкозов, лимфом и других лимфопролиферативных заболеваний.

Известен способ определения концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы 10 .(КДТ), основанный на предварительной очистке КДТ от примесей других полимераз. После выделения фермента в чистом виде из биологического источника неочищенного фермента 15 определяют ферментативную активность ,КДТ инкубацией в растворе, содержащем матрицу-затравку и радиоактивно меченный нуклеозидтрифосфат, полнмеризованный радиоактивный продукт синтеза, связанный с затравкой, осаждают на фильтре, который промывают кислотой для удаления кислоторастворимого радиоактивно меченного нуклеозидтрифо :фата и количество образующегося. радиоактйвного по.лимерного продукта ферментативного синтеза определяют радиометрированием фильтра (1).

Недостатками этого способа яв-. ЗО ляется то, что очистка фермента,. включающая выделейие лимфоцитов нэ крови, их ливис, Цеитрнфугирование лизата, иэбирательиугв сорбцию содержащегося в лМзате Фермента на фосфоцеллюлозу последующее отделение фосфоцеллюаозы от лизата, отмывание Фосфоцеллюлозы, десорбцию фермента с отмытой фосфоцеллюлозы, трудоемка, ведет к раэбавлению фермента элюирующим раствором, что нежелательно, поскольку

;объемы биологических .образцов, получаемых от больных, например, крови, ограничены;

Наиболее близким к предЛагаемому

45 является сПособ определения ЕДТ, включающий использование в качестве источщика Фермента неочищенного биологического образца Этот способ заключается в инкубировании с матрицей-затравкой и меченым нук леозидтрифосфатом непосредственно супернатанта лизированных лимфо-. цитов, содержащего наряду с ЕДТ другие матричные ДНК-полимеразы, ДНКаэы t, протеазы, ДНЕ в комплексе с белками. В качестве матрицызатравки исаальзуют олигодеэоксиадеииловую кислоту (ояигод As ) а в качестве мечеиого нуклеозид- 4Q трифосфата - дезоксигуаноэинтрифосфат - Н, далее обрабатывают, как описано вьыеь Указанный способ максимально прос, предусматривает возможность определейия активности КТД не только в супернатантах лиэатов лимфоцитов., но н в межклеточных жидких средах, где она может выполнять физиологически и патологически значимый . синтез (2 3.

Однако известный способ не рассчитан на одновременное получение инФормации об активности КТД, проявляемой.ею как на произвольно добавляемых в среду инкубации экзогенных затравках, так н на затравках эндогенного происхождения предшествующих в неочищенном биологическом источнике Фермента.

Коммерческие олигод А @.гЗ, используемые в способе, малодоступны, лабораторный синтез их трудоемок.

Применение затравок олнгод А8 г8 в случае образования на них продуктов синтеза приводит -на этапе промывания кислотой прецнпитата на фильтре к утрате части затравок радиоактивньнг продуктом в составе кислоторастворимой фракции что приводит к снижению чувствительности способа.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа, а также возможность осуществления способа в нативном материале.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности концевой дезоксинуклеотиднлтр@нсферазы включающему инкубацию исследуемого материала с матрицей-затравкой и радиоактивно меченым нуклеозидтрифосфетом, выделение полимеризованного радиоактивного продукта на Фильтре и радиометрироваиис целевого .продукта, в качестве затравки . используют денатурированную ДНК, при этрм ее вводят в инкубационную смесь в Фиксированном состоянии на ДЕАЖфильтре,. дополнительно вводят контрольный ДЕАЕ-фильтр, далее ДЕАЕ-* фильтры переносят в раствор немечейного нуклеозидтрифосфата, проводят радиометрический анализ обоих фильтроа и активность ферментов определяют ло сумме двух значений.

В случае использования в качестве матрицы-затравки денатурированной

ДНК ДЕАЕ-бумагу перед помещением в раствор с избытком немеченного нуклеозидтрифосфата дополнительно выдерживают s растворе ДНКазы.

Способ осуществляют следующим об разом.

Фильтры приготовляют в вице полудисков диаметром.22 мм ию ДЕАЕ-бумаги {sex га, ФРГ, емкость, 0,4 мэкв/г1,. выдерживают их 20 мин в растворе денатурированной ДНК (молекулярная массй не менее 1х10 дальтон ) концентрации 1,5 мг/мл до насыггения, промывают дистиллированной водой

1057852 для удаления несвязавшнхся с фильтром молекул. Активацию денатурированной ДНК производят вьщерживаннем

15 мин в растворе ДНКазы 1 концентрации 4 мг/мл с последующим промыванием водой и дополнительным насыщением остаточных свободных, мест связывания выдержнванием 20 мнн в

0,04 M растворе немеченых дезоксигуанозинтрифосфата .или аденозинтрифосфата.

Приготовленные таким образом фильтры из ДЕАЕ-бумаги сохраняются в сухом состоянии неограниченное время перед использованием.. Для учета синтеза на эндозатравках фильтры не требуют предварительной обработки, их нарезают из ДЕАЕ-бумаги.

Пример 1.. В качестве биологического источника фермента применяют межклеточную среду тнмоцнтов крыс, для чего суспензию клеток г,10"клеток/мл 1)npcne выделения их йз тимуса крыс-общепринятым методом

Освобождают от клеток центрифугированнем ((800 д; затем 100.000 д. J

100 мкл суперйатанта соединяют с

160 мкл Bs-какодилатного буфера (250 мИ Ыа-какодилата, 1 мг. бйчьего сывороточного .альбумина3, 300 мИ ИаС1, содержащего 2 ьИI Й) дГТФ с удельной активностью

9,25 ГБК/миоль и 1,2 мИ МпС12. Сра" зу после соединения двух объемов

B общий объем помещают фильтры иэ ДЕАЕ-бумаги.

При.необходимости объем супер-, натанта может быть уменьшен в 10 раз нрн соответствующем уменьшении объема буфера и площади фильтров.

Очередность внесения блокированнОго экзоэатравкой или свобсЩно,го фильтра в инкубационный растворпронэвольная в зависимости от целей эксперимента, однако при установлении соотношения двух видов синтезами на эндо- и экзозатравках два фильтра вводят в инкубационный раствор одновременно с биологическим источни» ком неочищенного фермента и раствор инкубнруют при 27 С одинаковое вре мя (20 мнн:).. 3a начало отсчета вре- мени синтеза на энцозатравкак принимают момент соеДинения источника фермента с,меченныги предшественниками, а синтеза на экзозатравкахмомент погружения фильтра - носителя затравки, в инкубационный объем, После изъятия фильтров из инкубационного раствора их ополаскивают от остатков. инкубационного раствора

1 л дистиллированной воды и высушивают, затем выдерживают в 1,5 мл аствора немеченного трифосфата, 0,04 И АТФ или дГТФ ) 3 ч при 50 С для удалЕния с бумаги остатков радиоактивного нуклеозидтрифосфата путем его замещения немеченным трифосфатом. Затем фильтры промывают 1 л дистиллированной воды, сушат и радиометрирувт.. Результаты выражают в едиHHlJGx ферментатнвной активности КДТ, 1 ед- 1 нмоль полиглеризованного мономерного предшественника на 108 клеток ,за 1 ч.

Соотношение двух видов синтеза в данном примере составляет С „здС

-"0,47:0,53 при суммарной активности

10 фермента равной 1,2 ° 10 2 ед.

Пример 2. Все операции вы- полняют как в примере 1, только производят последовательное помещение в инкубационный объем вначале свободного фильтра.:(для учета активности фермента на эндоэатравках ), а спустя 20 мин его заменяют фильтром с ДНК-затравкой (ддя учета активности фермента на.экзозатравке);

Соотношение С „ :Сз,г осоставляет

0,27:0,73 при суммарной активности . фермента равной 1,9 ° 10"2 ед; . Пример 3. Лимфоидные клетки выделяют иэ крови лкгдей известным д методом В градиенте фикола суспен зню клеток объемом 0,3 мл с концентрацией 1-1,5- ° 10 клеток/мл в какодилатном буфере -((125 мИ Na какодилатс, 5 мИ дитиотр-ейтола, 0,5 мг бычьего сывороточного альбумина H 150 мй МвС1) после выделения подвергают ультразвуковой обработке на установке VPCK-7Н при температуре тающего лида при

27 кГц по 2 с 10 раз. с интервалами . 30 с н центрифугируют при 100.000 д.

35 Полученный таким образом супернатант:биологическнй источник фермента объемом 100 мкл соединяют со 100 мкл раствора рН 3- дГТФ. (2 мИ удельиая активность 0,25 ГБК/мголь) на вьше

4Q описанном какодилатном буфере, содержащем 1,? мИ Мпс12.

У больной, страдающей лимфопролиферативныа заболеванием, при одновременном режиме ннкубации фильтров щ установлена активность КТД на экзоэатравке - 5,1 ед;, на эндозатравке

3,2 ед.;.суьмарный синтез - 8,3 ед.

Активность КДТ, определенная по известному способу - 1,24 ед. Замена

Яв в среде инкубации на К+ приводит к увеличению компоненты активности на экзозатравке до 5,6 ед.г что указывает на ограниченную приГодность иммобилизованной на анионнообменнике ДНК служить матрицей для матричных полимераз, так как этот

Внд синтеза не превышает 10%, но в

To me время оправдывает применение нигибирующей матричные полимеразы

:концентрации Иа+ в предлагаемом способе, у 8 человек, не страдающих лимфопроЛиферативньми забслйвайиями, получено среднее значение суммарной активности ферментa при одновремен-

1057852

Составитель В. Кузьмичев

Редактор М. Ткач Техред Ж. Кастелевич, Корректор O. Тигор

Заказ. 9579/47 Тираж 523- Подп:и снсе

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул. Проектная, 4 ной инкубацин анионообменннков, равное 0,4+0,17 ед. Средняя активность фермента, установленная по известному способу, — 0,082 ед.

Таким образом, предлагаемый способ. поэвопяет увеличить чувствительность по сравнению с известным примерно в 5 раэ, дает принципиально новую информацию о соотношении двух видов активности фермента на затравках различного происхождения: беэ увеличения количества опытов, позволяет заменить малодоступные олиго- и поли-д(Л 7 дешевой денатурированной ДНК без ущерба для селективных в отношении КДТ свойств способа за счет иммобилизации ДНК на фильтре из ДЕЛЕ-бумаги и увеличения в ней количества активных концов, за счет обработки ДНКазой и упро- щает выполнение процедур по приготовлению инкубационного раствора, так как та часть процедур, которая связана с приготовлением вкэозатра10 вок, может выполняться заранее и. при приготовлении инкубационного раствора сводиться к минимуму — погружению готовых фильтров из ДЕЛЕбумаги в раствор.