Способ культивирования бактериофагов энтеробактерий

Способ культивирования бактериофагов энтеробактерий

Реферат

 

(19)SU(11)1058283(13)A1(51)  МПК ⁶    _C12N7/00(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 27.12.2012 - прекратил действиеПошлина:

(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Изобретение относится к микробиологии, в частности к производству медико-биологических препаратов. Известен способ культивирования бактериофагов энтеробактерий, в частности бактериофага Флекснера, заключающийся в выращивании бактерий-хозяев в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим заражением бактериофагом гомологичного вида и инкубированием посевов. Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода бактериофага (выход 710¹⁰ ч./мл). Цель изобретения повышение выхода бактериофага. Поставленная цель достигается тем, что в способе культивирования бактериофагов энтеробактерий путем выращивания бактерий-хозяев в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим заражением бактериофагом гомологичного вида и инкубированием посевов, отличием является то, что культивирование бактерий проводят в питательной среде, содержащей 0,15-0,25% аминного азота, 0,5-0,9% пептонов, 0,15-0,3% глюкозы, 0,1-0,5% глицерина, 0,1-0,3% Na₂HPO₄, вода остальное, при рН 7,2-7,8, посевной дозе 0,1-5% от максимальной концентрации бактерий, скорости перемешивания 500-1200 об/мин, скорости аэрации 0,5-2 объема воздуха (объем питательной среды в 1 мин и концентрации растворенного кислорода 40-70% от полного насыщения, а заражение бактериофагом осуществляют в первой половине фазы экспоненциального роста бактерий при достижении концентрации последних 2-10 млрд.кл./мл и инкубацию проводят при тех же значениях рН и рО₂. Эта цель достигается также тем, что бактерии заражают бактериофагом из расчета 1 фаговая частица на 1-500 бактериальных клеток и инкубирование проводят в течение 30-60 мин. Способ осуществляют следующим образом. Бульонную 18-часовую культуру бактериальных клеток засевают в ферментер до концентрации 2-9 х 10⁷ кл./мл в питательную среду с указанным составом и выращивают в ферментере в условиях, которые также указаны выше. Культуру выращивают до концентрации 2-10 х 10⁹ в 1 мл таким образом, чтобы она находилась в фазе экспоненциального роста и характеризовалась удельной скоростью 1,1-2,3 ч^-1; временем генерации 0,3-0,7 ч, числом нуклеидов на 1 бактериальную клетку 1,7-2,5, была на 85-95% представлена жизнеспособными и на 65-85% многоядерными бактериальными клетками. Заражение культуры фагом проводят в том же ферментере из расчета 1 фаговая частица на 1-2 бактериальные клетки, затем смесь фага с бактериями инкубируют в том же режиме рН, рО₂ в течение 30 мин, добавляют в нее хлороформ (1-5% от объема) и фильтруют через стерилизующие фильтры. П р и м е р 1. Размножение бактериофага Зонне S-1 проводят в ферментере "Хемап" марки F-0020. Система перемешивания представляет собой комплекс турбинной мешалки со ступицей, направляющим приспособлением и отбойниками. Аэрацию осуществляют через трубу кольцевидной формы с отверстиями. Культивирование проводят в мясоказеиновой питательной среде, содержащей аминного азота 200 мг пептона 0,7% глюкозы 0,2% глицерина 0,15% Na₂HPO₄ 0,15% рН 7,2-7,8. Для размножения бактериофага S-1 используют штамм Sh. Sonnei N 28, находящийся в вирулентной 1 фазе, который хранят на 0,4%-ном агаре, приготовленном на панкреатическом гидролизате казеина. В качестве посевной используют 18-часовую бульонную культуру Sh. Sonnei N 28, выращенную из колонии 1 фазы, снятой под контролем стереомикроскопа. Посевную культуру и культуру в ферментере выращивают на одной и той же среде. В процессе культивирования штамма Sh. Sonnei N 28 определяют концентрацию микробных клеток по оптическому стандарту мутности, а также по подсчету в камере Горяева. Окраску мазков при изучении морфологии бактериальной популяции делают по методу Гимза. Удельную скорость роста () вычисляют по формуле время генерации td количество нуклеидов на 1 бактериальную клетку определяют как частное от деления всего количества ядер на количество клеток, в которых они были сосчитаны. Количество многоядерных и жизнеспособных клеток определяют в при просмотре 3-5 полей зрения в мазке. Кинетику адсорбции и одиночного цикла размножения фага определяют классическими методами М.Адамса, титр фага методом Грациа. Для получения бактериофага в питательную среду, находящуюся в ферментере, засевают 18-часовую бульонную культуру микробных клеток до концентрации 5 х 10⁷ в 1 мл. Культивирование проводят при температуре 37^оС и рН 7,2-7,8. Стабилизацию рН проводят стерильными 0,1 н. растворами HCl и NaOH. Количество пропускаемого в 1 мин воздуха 0,5-2,0 от объема питательной среды в 1 мин и число оборотов мешалки 500-1200 в 1 мин устанавливают в соответствии с показаниями датчика рО₂, поддерживая концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в значениях 40-70% от полного насыщения. После 3,5-4,5-часового культивирования при максимальных значениях удельной скорости роста (1,1-2,3 ч^-1), числа жизнеспособных клеток (85-95%), числа многоядерных клеток (65-85%), нуклеидов (1,7-2,5) и минимальном времени генерации (0,3-0,7 ч), когда концентрация микробных клеток достигает 2-10 х 10⁹ в 1 мл, в ферментер добавляют бактериофаг из расчета 1 фаговая частица на 1-2 бактериальные клетки. Уже через 5 мин 91% добавленного фага адсорбируется на бактериальных клетках. Латентный внутриклеточный период размножения фага S-1 длится 15-20 мин и заканчивается массовым лизисом бактериальных клеток с урожайностью 150-300 фаговых частиц на 1 инфицированную бактериальную клетку и конечным титром 0,4-2x10¹² в 1 мл. Лизис сопровождается просветлением культуральной среды до 10 ед. по оптическому стандарту мутности, концентрация микробных клеток, определенная подсчетом в камере, составляет при этом 1-310⁸ в 1 мл. Затем в фаголизат добавляют хлороформ в количестве 1-5% от объема среды, что позволяет повысить титр фага в 2-3 раза до 0,8-3 10¹² в мл в связи с дополнительным лизисом клеток под действием хлороформа. После 1-часового выдерживания фаголизата с хлороформом фаголизат фильтруют через стерилизующие фильтры с целью стабилизации титра фага. П р и м е р 2. Размножение бактериофага Флекснера F-1 проводят в ферментере "Хемап" F-0020 в питательной среде с источником азота в виде гидролизата казеина, содержащей 0,15-0,25% аминного азота, 0,5-0,9% пептонов; 0,15-0,3% глюкозы; 0,1-0,5% глицерина; 0,1-0,3% Na₂HPO₄, остальное вода. Для размножения бактериофага F-1 используют штамм шигелл Флекснера, типичный по своим культуральным и серологическим свойствам, находящийся в вирулентной гладкой форме. Определение удельной скорости роста бактериальной популяции, времени генерации, количества нуклеидов на 1 бактериальную клетку, кинетики адсорбции и размножения фага проводят методами, описанными в примере 1. Для получения бактериофага в питательную среду, находящуюся в ферментере, засевают 18-часовую бульонную культуру бактерий хозяина до концентрации 2-910⁷ в 1 мл и культивируют ее при температуре 37^оС, рН 7,2-7,8, количестве пропускаемого воздуха 0,5-2 в 1 мин от объема культуральной среды; числе оборотов мешалки 500-1200 в 1 мин и рО₂ 40-70% от полного насыщения. После 3-4-часового культивирования, когда бактериальная популяция находится в первой половине фазы экспоненциального роста при максимальных значениях удельной скорости роста (1,2-2,2 ч^-1), числа жизнеспособных клеток (85-98% ), числа многоядерных форм (68-87%), нуклеидов (1,6-2,5) и минимальном времени генерации (0,3-0,7 ч), и концентрации микробных клеток 4-1010⁹ в 1 мл в ферментер добавляют фаг из расчета 1 фаговая частица на 1-500 бактериальных клеток. Латентный период внутриклеточного размножения фага длится 20-25 мин и заканчивается лизисом бактериальной популяции с урожайностью 300-500 фаговых частиц из 1 инфицированной клетки. При множественности заражения 1/1 лизис протекает в один цикл и заканчивается через 20-30 мин, при множественности заражения 1/300-1/500 лизис протекает в два цикла и заканчивается через 45-65 мин. В фаголизат добавляют хлороформ (1-5% от объема среды) и фильтруют через стерилизующие фильтры с целью стабилизации титра фага. Конечный титр фаголизата (фага) 1-410¹² в 1 мл. П р и м е р 3. Культивирование бактериофага Jersinia enterocolitica-127 проводят в ферментере "Хемап" F-0020 в питательной среде с источником азота в виде гидролизата казеина, содержащей 0,15-0,25% аминного азота; 0,5-0,9% пептонов; 0,15-0,3% глюкозы; 0,1-0,5% глицерина; 0,1-0,2% Na₂HPO₄, pH 7,2-7,4. Для культивирования фага используют штамм Jersinia enterocolitica-161, типичный по своим культуральным и серологическим свойствам, находящийся в вирулентной гладкой форме. Определение удельной скорости роста бактериальной популяции, времени генерации, количества нуклеидов на 1 бактериальную клетку, кинетики адсорбции и размножения фага проводят методами, описанными в примере 1. Для получения бактериофага в питательную среду, находящуюся в ферментере, засевают 24-часовую бульонную культуру бактерии-хозяина до концентрации 0,4-110⁹ в 1 мл. Культивирование проводят при температуре 22^оС, при рН 7,2-7,4. Температура культивирования 22^оС позволяет предотвратить диссоциацию штамма и утрату Н-антигена. Стабилизацию рН проводят 0,1 н. растворами NaOH и HCl. Количество пропускаемого воздуха в 1 мин 0,5-2 от объема культуральной среды и число оборотов мешалки (500 в 1 мин) устанавливают в соответствии с показаниями датчика рО₂, поддерживая концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в значениях 40-70% от полного насыщения. После 4-6 ч культивирования в первой половине фазы экспоненциального роста при максимальных значениях удельной скорости роста бактериальной популяции (0,5-0,8 ч^-1), числе жизнеспособных клеток 80-95% многоядерных форм 70-90% нуклеидов 1,8-2,0 и минимальных значениях времени генерации 1,4-0,9 ч, когда концентрация микробных клеток достигает 3-510⁹ в 1 мл, в ферментер добавляют бактериофаг из расчета 1 фаговая частица на 1-100 бактериальных клеток. Латентный период внутриклеточного размножения фага длится 20-25 мин и заканчивается лизисом с урожайностью 80-100 фаговых частиц на 1 инфицированную бактериальную клетку. Полный лизис бактериальной популяции наступает при множественности заражения 1/1 через 30-35 мин (один цикл) и при множественности заражения 1/80 100 через 60-80 мин (два цикла внутриклеточного размножения фага). В фаголизат добавляют хлороформ и фильтруют через стерилизующие фильтры. Количество добавляемого хлороформа 1-5% от объема культуральной среды. Конечный титр бактериофага в фаголизате 10-5010¹⁰ мл. Использование предлагаемого способа размножения бактериофагов на экспоненциально размножающейся культуре бактерий в условиях оптимальных значений рО₂, рН, а также оптимальной множественности заражения позволит повысить титр бактериофагов в 10-100 раз; сократить объем производства фага в 100-1000 раз в связи с увеличением титра во столько же раз, уменьшив потребление питательной среды; повысить титр фага в лечебно-профилактических препаратах, сделав их более эффективными.

Формула изобретения

1. СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ путем выращивания бактерий-хозяев в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим заражением бактериофагом гомологичного вида и инкубированием посевов, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода бактериофага, культивирование бактерий проводят в питательной среде, содержащей 0,15-0,25% аминного азота, 0,5-0,9% пептонов, 0,15-0,3% глюкозы, 0,1-0,5% глицерина, Na₂ HPO₄ 0,1-0,3% вода остальное, при рН 7,2-7,8, посевной дозе 0,1-5% от максимальной концентрации бактерий, скорости перемешивания 500-1200 об/мин, скорости аэрации 0,5-2 объема воздуха/объем питательной среды в 1 мин и концентрации растворенного кислорода 40-70% от полного насыщения, а заражение бактериофагом осуществляют в первой половине фазы экспоненциального роста бактерий при достижении концентрации последних 2-10 млрд.кл/мл и инкубацию проводят при тех же значениях рН и рО₂. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактерии заражают бактериофагом из расчета 1 фаговая частица на 1-500 бактериальных клеток и инкубирование проводят в течение 30-60 мин.