Способ иммобилизации @ -лизиндекарбоксилазы

Способ иммобилизации @ -лизиндекарбоксилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ L-ЛИЭИНДЕКАРБОКСНЛАЗЫ путем связывания фермента с водонерастворимым носителем/ отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопропилсилохром , модифицированный монобромуксусной кислотой и N,N -дициклогексилкарбодиимидом , взятыми в зквивалентных количествах. а Jo т90ea-j 70Wясл со ю JsP Фиг.1

(1% (1И

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦ)4АЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

АЖ 100

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbITHA (21) 3488923/28-13 (22) 07. 06. 82 (46) 07. 12. 83. Бюл. Ф 45 (72) Б.И.Ческис, (0.И.Веножинскене, Р.П.Янушявичюте, A.-A.Á.Ïàóëþêîíèñ и Д. А. Казлаускас (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энэимологии (53) 577. 15. 07 (088. 8) (56) 1. Wh1te W.Ñ., Guitbaut G.G °

Aaalyt.. Chem. 1978, чо1. 50, р. 148.

2. Tanaka A. et at. 7огиаК of

Ferment. Technotogy. 1980, vot. 58, р. 391 °

ЗЯ С 12 N 9/88; С 12.N 11 14 (54) (57) СПОСОБ ИММОБИЛИЭАЦИИ L-ЛИЭИНДЕКАРБОКСЦЛАЭИ путем связывания фермента с водонерастворимым носителем; о т л и ч а ю щ и и с, я тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопропилсилохром, модифицированный монобромуксусной кислотой и N,N -диI циклогексилкарбодиимидом, взятыми в эквивалентных количествах.

1059002

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации фермента L-лизиндекарбоксилазы, и предназначено для использования в микробиологической промышленности и в производстве биохимических реактивов.

Известен способ иммобилизации

L-лизиндекарбоксилазы путем нанесения на поверхность СΠ— селективных электродов раствора бычьего сывороточного альбумина, растворения в нем фермента и обработки смеси глутаральдегидом (1 .

Однако такой способ иммобилизации пригоден только для получения 15 иммобнлизованной Ь-лизиндекарбоксила« зы, локализованной на поверхность

СΠ— селективного электрода. Полученная таким способом иммобилизованная L-лизиндекарбоксилаза не мо- 20 жет быть использовайа в установках других типов (кроме тех, где используется СО 2 — селективный электрод), это .ограничивает область ее применения.

Наиболее близким к предлагаемому .по технической сущности является способ иммобилизации Ь-лизиндекарбоксилазы путем св.язывания фермента с водонерастворимым носителем, в качестве которого используют внутреннюю поверхчость стеклянной трубки, силанизированную винилтриэтоксисиланом (используется смесь винилтриэтоксисилана, метанола и воды) °

Иммобилизацию осуществляют, нанося на силанизированную поверхность стеклянной трубки раствор фермента, содержащий бензоинизобутиловый эфир (растворенный в полипропиленгликоле) и преполимер эмульсионного типа, 40 состоящий из поливинилацетата, поливинилового спирта и гидроксиметилакриламида. Смесь освещают ультрафиолетовым светом в атмосфере азота. слой иммобилизованного Фермента еще 45 дважды покрывают смесью бензоиыизобутилового эфира и преполимера, каждый раз повторяя освещение ультрафиолетовым светом в атмосфере азота P2) .

Недостатком известного способа является то, что он технологически сложен и трудоемок, требует большого ассортимента реактивов, в том числе такого труднодоступного как бензоинизобутилсвый эфир.

Целью изобретения является упрощение способа получения иммобилизованной L-лизиндекарбоксилазы, Указанная цель достигается способом иммобилизации Ь-лизиндекарбок- 60 силазы путем связывания фермента с водонерастворимым носителем, в качест ; ве носителя используют аминопропилсилоХром, модифицированный монобромуксусной кислОтОЙ и Nр, N -ДициклОГек- 65 ! силкарбодиимидом, взятыми в эквивалентных количествах.

В. качестве водонерастворимого носителя использован модифицированный бромацетамидными группами силохром и фермент связывают с таким силохромом при помощи реакции алкилирования нуклеофильных групп фермента.

Предлагаемый способ является достаточно простым по технологии и, кроме того, позволяет получить иммобилизованную L-лизиндекарбоксилазу с довольно высокой удельной активностью (3000-3500..мк моль/мин ° r).

Полученный по предлагаемому способу уровень активности значительно превышает средний уровень активности иммобилизованных ферментов (по известному способу 300-500 мк моль/мин г)

Для получения иммобилизованного фермента с максимально высокой активностью (фиг.1 и 2) целесообразно осуществлять процесс при рН 6,6-7,3 и весовом соотношении белок/носитель

45-55 мг/г. При остальных значениях этих параметров процесс имМОбилизации менее эффективен с точки зрения достигаемого уровня активности.

На фиг.1 изображена зависимость активности иммобилизованной Ь-лизиндекарбоксилазы От рН иммобилизации; на фиг.2 - зависимость активности иммобилизованной L-лизиндекарбоксилазы от исходного весового соотношения фермент/носитель при рН иммо)билизации 7,2.

Пример 1. Способ иммобилизации L-лизиндекарбоксилазы.

Получение силохрома, модифицированного бромацетамидными группами.

10 r аминопропилсилохрома CX-2,5 суспендируют в 40 мл диоксана, содержащего 1,12 г монобромуксусной кислоты, и прибавляют раствор эквивалентного количества (1,16 г)

N N -дициклогексилкарбодиимида в

10 мл диоксана. Смесь перемешивают на качалке при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего носитель промывают путем декантации водой для удаления побочного продукта реакции — дициклогексилмочевины.

Связывание Ь-лизиндекарбоксилазы с носителем.

К 10 г модифицированного силохрома прибавляют 100 мл раствора

L-лизиндекарбоксилазы Escherichia

cori в 0,05 М фосфатном буферз рН 7,2 и перемешивают на качалке

10-15 ч. Иммобилизованный фермент фильтруют и промывают на фильтре

0,05 М фосфатным буфером рН 5,7, содержащим 5 10 М пиридоксильфосфат, 10 М трилон Б и 0,01% меркаптоэтанол. Полученный препарат хранят в холодильнике (+4-6 С). Активность иммобилиэованного фермен1059002

Фермена/юосишел, иг г

Фиг.2

Составитель О.Скородумова

Редактор Н.Рогулич Техред Л.Пилипенко

КорректорИ.Эрдейи

Заказ 9711/24 Тираж 523

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, М-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 та 3400 мк моль/мин ° г, выход в процессе иммобилизации 553.

Использование предлагаемого способа получения иммобилизованной

L-лизиндекарбоксилазы обеспечивает по сравнению с известным способом следующие преимущества: предлагаемый способ технологически проще, поскольку не требует таких трудномасштабируемых операций как силаниэация.стеклянной поверхности, многократное нанесение смеси реактивов тонким слоем на стеклянную поверхность, исключает необходимость работать в атмосфере азота. Для реализации способа не требуется большого ассортимента реактивов, в том числе такого труднодоступного и дорогостоящего реактива как бенэоиниэобутиловый эфир. Предлагаемый носитель и реактивы для его активации дешевы и ® выпускаются отечественной промышленностью. Остальные реактивы, а именно Ь-лизиндекарбоксилаза, пиридоксальфосфат, трилон Б и меркапто" этанол, используют при любом способе иммобилизации, так как они необходимы для проявления и стабилизации ферментивной активности.

Иммобилизованная L-лизиндекарбок« силаза используется для определения концентрации L-лизина при микробиологическом его производстве, а также для анализа L-лизина в пищевом и кормовом сырье и продуктах, в научно-исследовательских работах и других областях. Высокая активность иммобилизованного фермента позволяет достичь полного декарбоксилирования субстрата в течение нескольких минут. Это существенно ускоряет и упрощает определение концентрации

L-лизина, в частности позволяет исключить термостатирование, которое необходимо при использовании малоактивных иммобилизованных препаратов, работающих в кинетическом режиме.