Способ определения негемадсорбирующих вирусов

Способ определения негемадсорбирующих вирусов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕГЕМАДСОРБИРУКХДИХ ВИРУСОВ путемих выращивания в культуре ткани с последующим наслоением суспензии стафилококков Cowan 1, сенсибилизированных противовирусной сыв-ороткой, инкубированием реакционной системы и учетом полученных результатов, о т л ич а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения способа, стафилококки дополнительно сенсибилизируют антиэрктроцитарной сывороткой, при этом противовирусную и антиэритррцитаркую сыворотки берут в количестве 100 вируснейтралиэующих и 100 гемолитических доз соответственно, после инкубирования добавляют взвесь эритроцитов и определяют вирус по (Л наличию гемадсорбции.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

3(59 С 12 М 7 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPGHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗ06РЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3384624/28-13 (22) 22.01.82 (46) 15.12.83. Бюл. 9 46 (72) О.A.Àêñåíîâ и И.Л.Коган (71) Ленинградский ордена "Знак Почета" научно-исследовательский институт детских инфекций (53) 576.858(088.8) (56) 1. Vogel j Shelokov А.

Adsorption-hemagglutination test

for influenza virus in monkey

kidney tissue culture. †"Science", 1957, 126, р. 358-359.

2 Modline J.F. Huang АеSе

"Detection of herPes .simPlex virus

tipe I — infected Cells by bacterial

adherence. Agents and Chemother

Boston, Маss. 1979, vol I,,Mashing»

;ton, D.c. 1980, р. 536 (прототип).

„ЛУ;„,1060Яф A (54),(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕГЕИАДСОРБИРУЮЦИХ ВИРУСОВ путем их выращивания в культуре ткани с последующим наслоением суспензии стафилококков Cowan 1, сенсибилизированных противовирусной сывороткой, инкубированием реакционной системы и учетом полученных результатов, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, стафилококки дополнительно сенсибилизируют антиэритроцитарной сывороткой, при этом противовирусную и антиэритроцитарНую сыворотки берут в количестве

100 вируснейтрализующих и 100 гемолитических доз соответственно, после инкубирования добавляют взвесь е эритроцитов и определяют вирус по наличию гемадсорбции..

1060674

Изобретение относится к вирусологии и касается способа определения негемадсорбирующих вирусов.

Известен способ определения вирусов в реакции гемадсорбции на поверхности зараженных клеток 1).

Однако известный способ не позволяет определить генемадсорбирующие вирусы.

Известен .способ определения негемадсорбирующих вирусов, например вируса.герпеса, путем их выращивания в культуре. ткани с последующим наслаиванием суспензии стафилококков

Cowan 1, сенсибилизированных противовирусной сывороткой, инкубирова- f5 нием реакционной системы и учета полученных результатов f2 ).

Однако известный способ трудоем= кий, так как предусматривает сложную методику подготовки вирусов для 7р учета результатов.

Цель изобретения — упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определе. ния негемадсорбирующих вирусов путем их выращивания в культуре ткани с последующим наслоением суспенэии стафилококков Covan 1, сенсибилизированных противовирусной сывороткой, инкубированием реакционной системы и учетом полученных результатов, стафилококки дополнительно сенсибилизируют антиэритроцитарной сывороткой, при этом противовирусную и антиэритроцитарную сыворотки берут в количестве 100 вируснейтрализующих и 100 гемолитических доз соответственно; после инкубирования добавляют взвесь эритроцитов и определяют вирус по наличию гемадсорб-.40 ции.

Способ осуществляется следующим образом.

10%-ную взвесь золотистого стафилококка штамм Кован 1, инактивированную формальдегидом, соединяют с гипериммунными сыворотками двух видов — против искомого вируса и гемолитической в соотношении 1:1:1 по объему. Активность используемых 50 сывороток должна быть не менее 100 вируснейтрализующих доз для противовирусной сыворотки и не менее 100 гемолитических доз для противоэритроцитарной сыворотки ° Время контак. та сывороток со стафилококком—

40 мин при комнатной температуре.

Полученную взвесь стафилококков отмывают дважды в трехкратном объеме

ФБР рН-7,2 — 7,4. Для постановки способа используют 1%-ную взвесь стафилококков в ФБР. В каждую пробирку с зараженной культурой клеток и в контрольные пробирки вносят по

1 мл 1%-ной,.взвеси стафилококков и после 15-минутного контакта при комнатной температуре производят трехкратную отмывку клеточного плас,"та ФБР от неадсорбированных стафилококков. Далее в пробирки вносят по

1 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов, смесь инкубируют 10 мин и производят аналогичную отмывку ФБР. Наличие адсорбции эритроцитов на зараженные клетки определяют тремя способами: визуально по окрашиванию клеточного пласта в рыжий цвет; пол малым увеличением микроскопа (100 раз ) непосредственно в пробирках или матрицах; для количественного учета дозы вируса адсорбированные эритроциты:лизируют дистиллированной водой, внося ее по 1,5 мл в каждую пробирку и измеряют количество вируса по количеству гемоглобина, вышедшего из адсорбированных эритроцитов, на спектрофотометре при длине волны 410 нм по сравнению с контролями - незараженная культура клеток и дистиллированная вода.

Время постановки способа составляет 1 0 — 1,5 ч.

Пример 1. Для определения присутствия вируса герпеса простого готовят стафилококковый диагностикум путем соединения 2 мл 10%-ной взвеси стафилококков с 1 мл иммунной кроличьей противогерпетической сыворотки в разведении 1г3 (титр сыворотки 1:320 ) и 1 мл гемолитической кроличьей сыворотки против эритроцитов барана в разведении

1:10 (титр сыворотки 1:1200). После контакта в течение 40 мин при 20 С о полученный диагностикум 2 раза отмывают в ФБР с центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин.

Готовый препарат ресуспендируют до

10%-ной концентрации.

Культуру клеток Нер 2 заражают вирусом герпеса простого штамм Толстой в разведении 10 (титр вируса

10 1 и респираторно-синцитиальным (РС ) вирусом в разведении- 10 " (титр вируса 10 4). Через 1 и 2 сут после заражения в пробирки с зараженной культурой клеток и в контрольные пробирки вносят по 1 мл 1%-ного стафилококкового диагностикума.

После 15-минутного контакта при комнатной температуре диагностикум сливают и трижды отмывают клеточный пласт ФБР от неадсорбированных стафилококков. Затем в пробирки вносят по 1 мл 0,4% эритроцитов барана на 10 мин, после чего пласт снова отмывают ФБР и производят трехэтапный учет результатов: визуальный учет по окрашиванию пласта; полуколичественный учет под микроскопом (подсчет бляшек адсорбции ); количественный учет по количеству гемо1060б74

Таблица 1

Цитопатогенный эффект

Культура клеток

Количество дней после заражения.Визуальный

По количеству гемоглобина по сравнению с

Н20 в оптических ед (ОЕ) Под микроскопом

Незараженная

Отрицатель-,. ный

Отрицательный

Отрицательный

0,020

0,015

0,085

Около

40 бляшек

Слабое рыжеватое окрашивание пласта

Зараженная вирусом герпеса

0,400

Сплошная гемадсорб ция

Рыжее окрашивание пласта глобина в адсорбированных эритроцитах, для чего в каждую пробирку вносят по 1,5 мл дистиллированной воды. Количество гемоглобина определяют на спектрофотометре при .цлине волны 410 нм.

Полученные результаты представлены в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что адсорбция комплекса стафилококк-эритроцит на незараженную культуру клеток и на зараженную не соответствующим иммунной сыворотке вирусом клеточную культуру крайне незначительна (0,010

0,020 ОЕ ), а на зараженные вирусом герпеса клетки уже в первые сутки адсорбция эритроцитов превышает контрольный уровень в 4 раза (0,085 ОЕ ), на вторые сутки — более, чем в 20 раз (0,400). Цитопатоген-. ный эффект в зараженной вирусом герпеса простого клеточной культуре появился лишь на 7 сут и только по нему без постановки реакции нейтрализации идентифицировать вирус практически невозможно.

Пример 2. Осуществляют способ аналогично примеру 1, но определяют присутствие РС-вируса или аденовируса.

Результаты определения приведе- ны в табл. 2.

Из результатов опыта видно, что начиная,с первых суток после заражения культуры ткани возможно подучение гемадсорбции, превышающей контрольный уровень в 4 — 7 раз.

При этом одновременно с получе- .

10 нием гемадсорбции, учитывая применение специфических антивирусных сывороток, происходит и идентификация вируса. По сравнению с использованием реакции нейтрализации в куль

15 туре ткани, применяемой обычно, ответ может быть получен на 1-2 сутки после заражения культуры ткани . исследуемым материалом, т.е. на 510 дней раньше, чем в реакции нейтрализации.

Использование изобретения позволяет быстро выделить и идентифицировать этиологический агент, что значительно облегчает и сокращает вре25 мя работы по диагностике, что особенно важно при диагностике острых вирусных инфекций центральной нервной системы у детей.

Учет адсорбции эритроцитов

10б0674

Ю

Та.блица 2

Культура ткани

Диагностикум из стафилококка + антиэритроцитарная сыворотка +

Наличие

Ц П Э

Заражена РС + вирусом

О, 070

Отрицательный

0,295

0,420

0,450

Отрицательный

0,010- О, 025

+/++

Заражена

Адено вирусом

1 Отрицательный

1 н

0,015-0р035

Отрицательный

Незараженная

1-7 Отрицательный 0,010-0,030

1-7 0,010-0,035

Составитель А.Ианыкин

Редактор Н.Киштулинец Техред О.Неце Корректор О. Билак

Заказ 9971/28 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

I филиал ППП "Патейт", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

+ анти PC сыворотка

+ анти Ад сыворотка

Количество дней после заражения культу ры ткани

Учет гемадсорбции в оптических единицах

0,060

0,310

0,400

О,530