Способ получения иммобилизованной аминоацилазы

Способ получения иммобилизованной аминоацилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АМИНОАЦИЛАЗЫ, включающий. ковалентное связывание фермента с активированным силохромом, о т л иi4 а ю m и и G- я тем, что, с целью повышения стабильности иммобилизованного фермента, полученный продукт дополнительно обрабатывают водным раствором глиоксаля в соотношении 0,01-0,15 г глиоксаля на ,1 г препарата.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„.Su„„1060676

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕПЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3481577/28-13 (22) 08.06.82 (46) 15.12.83. Бюл. Р 46 (72) И.Г. Вейнберга, Е.С. Чухрай, О.М. Полторак, A.Ê. пренс, И.П. Розиня и A.Ï. Заньке (53) 577.15 (088.8) (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИОБИ.ЛИЗОВАННОИ АМИНОАЦИЛАЗЫ, включающий.

3 @ С 12 N 11/14, С 12 Б 9/78 ковалентное связывание фермента с активированным силохромом, о т л и. ч а ю щ и и с.я тем, что, с целью повышения стабильности иммобилиэованного фермента, полученный продукт дополнительно обрабатывают водным раствором глиоксаля в соотношении 0,01-0,15 r глиоксаля на ,1 r препарата.

1060676

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения препаратов иммобилизованных ферментов, которые используются в качестве гетерогенных катализаторов для трансформации органических соединений.

Известно большое количество способов иммобилизации аминоацилазы и, в т.ч. на неорганических носителях, например, путем ковалентного связывания с модифицированным у -аминопропилтриэтоксисиланом и и --нитробензоилхлоридом монтиориллионитом.

Недостатком способа является низкая активность иммобилизованного фермента и невысокая стабильность препарата.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является способ получения иммобилизованной аминоацилазы, включающий ковалентное связывание фермента с активи рованным силохромом. Активирование силохрома включает обработку аминопропилтриэтоксисиланом и последующую активацию h -бензохиноном. Характеристика препарата водонерастворимой аминоацилазы: содержание белка

47,85 мг/0,5 r носителя, ацилазная активность — 31,8 мкмоль L-метиони-l. на в минуту (0,5 r носителя), определенная в кинетической области, стабильность — при непрерывном про- пускании субстрата (раствора И-ацетил-Р,L-аминокислоты), катализатор сохраняет активность в течение 116 ч (для 5-ацетил-D,L-метионина) до

1110 ч. (для И-ацетил-D,L-серина). .Цель изобретения — повышение стабильности иммобилизованной аминоацил азы °

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованной аминоацилазы,включающему ковалентное связывание фермента с активированным силохромом, полученный продукт дополнительно об рабатывают водным раствором глиоксаля в соотношении 0,01-0,15 r глиоксаля на 1 г препарата.

Аминоацилаза является ферментом, состоящим из двух субъединиц, и процесс ее денатурации происходит в две стадии. На первой стадии происходит диссоциация фермента на субьединицы, причем на этой стадии теряется большенство исходной активности фермента. На второй стадии происходит денатурация отдельных мономеров. Скрепление четвертичной структуры ацилазы бифункциональными реагентами, глиоксалем исключает диссоциацию ацилазы и обеспечивает длительное сохранение каталитической активности фермента (до

2100 ч). С этой целью препараТы

65 фатном буфере с ацилазной активностью 6500 мкмоль/ч в мл, выдерживают 1 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают, промывают

2 ° 50 мл 1 М раствора хлористого натрия и 50 мл фосфатного буфера с РН 7,2.

К препарату иммобилизованной аминоацилазы приливают 2 мл раствора глиоксаля (500 мг в 10 мл иммобилизованной аминоацилазы после ковалентной иммобилизации на активированных силохромах обрабатывают водным раствором глиоксаля в весовых соотношениях 1:0,01-, 0,15.

П .р и м е р 1. К 1 г силохрома, обработанного у -аминопропилтриэтоксисиланом, прибавляют раствор

0,2 r и -бензохинона в 60 мл 70%-но го изопропилового спирта, выдержи10 вают при комнатной температуре 1 ч, отфильтровывают, промывают 3 ° 40 мл изопропилового спирта и 40 мл фос.фатного буфера с РН 7,2.

К активированному носителю при15 бавляют 4 мл буферного (фосфатный буфер с РН 7,2) экстракта ацетонового порошка свиных почек с ацилазной активностью 6900 мкмоль/г в мл и выдерживают при комнатной температуре. Отфильтровывают и промывают 2 50 мл 1 М хлористого натрия и 50 мл фосфатного буфера с РН 7,2.

К иммобилизованной аминоацилаэе приливают 2 мл раствора глиоксаля (50 мг в 10 мп фосфатного буфера

РН 7,2) и выдерживают 1 ч при комнатной температуре. Промывают

3 ° 50 мл фосфатного буфера рН 7,2.

ПолучаЮт препарат иммобилизованной аминоацилазы с;ацилазной актив30. ностью 3200 мкмоль/ч на г (определена в кинетических условиях).

Помещают 1 r препарата иммобилизованной аминоацилазы в термостатируемую колонку (37-40ОС) и пропускают через нее непрерывно 24,5 л

0,5 M раствора N-ацетил-D,L-метионина со скоростью 11,6 мл/ч (обеспечивающей образование 0,25 М раствора L-метионина в элюате) в течение

40 2100 ч. Из элюата обычным способом выделяют .L-метионин. Выход L-м тионина 822,5 г (89%) C477) = 22 ° 8 (с = 1.5 н. НСХ).

II р и м е р 2. К 1 г силохрома, обработанного - г -аминопропилтризтоксисиланом, прибавляют раствор

0,04 г активированного носителя ярко-голубого KX в 15 мл диметилформамида и оставляют на " 2 ч при

° 0 комнатной температуре. Продукт отфильтровывают, промывают 3 50 мл водой и 1 50 мл фосфатным буфером рН 7,2.

К активированному носителю прибавляют 2 мл экстракта ацетонового порошка свиных почек s 0,1 н. фосгов0676

Составитель В. Муронец

Редактор Киштулинец Техред Т.Фанта Корректор О. Тигор

Заказ 9971/28 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная,4 фосфатного буфера) и выдерживают

1 ч при комнатной температуре.

Промывают 3 50 мл фосфатного буфера рН 7,2.

Получают препарат иммобилизованной аминоацилазы с ацилазной активностью 1000 мкмоль/ч на г (определена в кинетических условиях).

Помещают 1 г препарата нммобилизованной. аминоацилазы в термостатируемую колонку (37-40 С) и пропускают через нее непрерывно 4,55 л

0,5 M раствора N-ацетил-D,L-метионина со скоростью 0,32 мл/ч (обеспечивающей образование 0,25 М раствора L-метионина в элюате) в течение 1420 ч.

Из элюата обычным способом вы-. деляют L-метионин. Выход L-метиони-; на 149,3 г.(883). jñÖD= 23 (с = 1,.

5 н. HCI).

Пример 3. 0,25 г м-фенилендиамина растворяют в 10 ьцт 1.N соляной кислоты. К раствору добавляют

1 г силохрома С- 80. Смесь охлаждают до 0-2 С и постепенно приливают о

10 мл 2%-ного раствора азотистокислого натрия в течение 0,5 ч. Смесь отфильтровывают, промывают водой до полного удаления окраски в про-, мывных водах, промывают 50 мл

0,1 N раствора фосфатного.буфера -с рН 7,2.

К активированному носителю прибавляют 2 мл экстракта ацетонового порошка свиных почек с ацилазной

;активностью 6520 мкмоль/ч в мл и выдерживают 2 ч при 4-9ОС. Отфильтровывают, промывают 2 50 мл 1 M раствором хлористого натрия и 50 мл фосфатного буфера.

К препарату иммобилизованной ацилазы приливают 2 мл раствора гли: оксаля (750 мг в 10 мл фосфатного буфера) и выдерживают 1 ч при комнатной температуре. Промывают

3 50 мл фосфатного буфера с рН 7,2.

Получают препарат иммобилизованной аминоацилазы с ацилазной активностью 2500 мкмоль/ч íà r (определена в кинетических условиях).

1О Помещают 1 г препарата иммобилизованной аминоацилазы в термостатируемую колонку (37-40 С). и пропускают через нее 17,2 л 0,5 М раствора. N-ацетил-D,L-метионина со

15 скоростью 9 мл/ч (обеспечивающей образование 0,25 М раствора L-метио нина в элюате) в течение 1950 ч.

Из элюата обычным способом вьщеляют L-метионин.

Выход Ь-метионина 546,5 г (88В).

f4)y- =22,7 (с = 1,5 í. HCI).

Технико-экономический эффект изобретения заключается в стабилизации иммобилизованных препаратов аминоацилазы и применение стабилизированных препаратов иммобилизованной аминоацилазы в качестве гетеро-генного биокатализатора для получения оптически активных аминокислот, что Позволяет применять биокатализа. тор более длительное время,а в связи с этим увеличивается выход оптически активной аминокислоты, например, метионина, на 1 r катализатора с,49,24 до 822,5 г.

Каталитическая активность иммобилизованной аминоацилазы сохраняется в течение 1420-2100. ч по сравнению со 116 ч по прототипу (при использовании в качестве субстрата

40 N-ацетил-D,L-метионина). Таким образом, стабильность ферментного препарата возрастает в 12-18 раз.