Реагент для индикации микроорганизмов
Патент 1063835
Авторы
Реагент для индикации микроорганизмов
Иллюстрации
Реферат
РЕАГЕНТ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО ИХ дёгидрогеназной активности на основе соли тетразо лий,. отличающийся тем, что, с целью ускорения определения, он содержит соль тетразолия в виде- 2-9%-ного раствора в этиловом спирте и дополнительно содержит полиэтиленгликоль , трехзамещенный фосфат калия и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов вес.ч.: Полиэтиленгликоль20-30 Трехзамещенный фосфаткалия 17-28 2-9%-ный раствор i соли тетразолия в сл этиловом 0,51-0,55 спирте Дистиллированная Остальное вода
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ .
РЕСПУБЛИН (192 (112
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ABTOPCHOMV CBMQETEllbCTB Y
17-28
Остальное
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 ) 3407 378/23-1 3 (22) 05.03.82 (46) 36.12.83. Бюл. Р 48 (72) Ю.Т. Калинин, О.A. Бушуева, С.A. Кудрявцева, Л.A. Семенова, Е.Н. Храмов и В.В. Помазанов (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (53) 576.093.4(088.8) (56) 1., Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М., 1967, "Медицина", с. 422.
2. Срагец Г.Э. Определение ки-, шечной палочки с помощью индикаторной бумаги,- "Лабораторное дело", 1976, 22 4, c. 243-244., (54 ) (57 ) РЕАГЕНТ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ по их дегидрогеназной активности на основе соли тетразо3(512 С 12 Q 1/04, С 12 Q 1/32 лия,.отличaþùèéсятем, что, с целью ускорения определения, он содержит соль тетразолия в виде. 2-9%-ного раствора в этиловом .спирте и дополнительно содержит полиэтиленгликоль, трехзамещенный фосфат калия и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов вес.ч.г
Полиэтилен- . гликоль 20-30
Трехзамещенный фосфат калия
2-9%-ный раствор соли тетразолия в этиловом спирте 0,51-0,55
Дистиллированная вода
1063835
Поставленная цель достигается тем, что реагент для индикации микроорганизмов по их. дегидрогеназной активности на основе соли тетраэолия содержит соль тетразолия в виде
2-94-ного раствора в этиловом спирте и дополнительно содержит полиэтиленгликоль, трехэамещенный фосфат калия и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, вес.ч.: 40
Полиэтиленгликоль
Трехзамещенный фосфат 45 калия
2-9%-ный раствор соли тетразолия в этиловом спирте
Дистиллированная вода Остальное
Включенная в состав реагента (в виде спиртового раствора) соль тетраэолия играет роль индикатора реакции, осуществляемой дегидрогенаэами микроорганизмов, по которой и судят об их наличии, Полиэтиленгликоль и трехзамещенный фосфат калия в дис- Ю тиллированной воде образуют двухфазную систему, которая играет роль фона, на котором выявление микроорганизмов происходит особенно четко.
Бактерии, внесенные в систему, соби20-30
17-28
0,51-0,55
Изобретение относится к микро. биологии и медицине, в частности к реагентам для обнаружения микроорганизмов в жидкости.
Известно средство обнаружения бактерий по редуктазной активности 5 на основе реакции обеспечивания метиленового синего в присутствии исследуемой пробы при 38-40 С. Регистрация наличия бактерий в пробе осуществляется визуально по обесцве- 10 чиванию окраски пробы f1) .
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является реагент для индикации микроорганизмов по дегидрогеназной активности, состоящий из носителя — бумаги, пропитанной хлоридом 2,3,5-трифенилтетраэолия и питательной средой.
При использовании его смачивают анализируемой жидкостью и инкубируют в течение 12-14 ч. В случае наличия микроорганизмов возникает красное окрашивание )2) .
Недостаток известного реагента длительное время анализа из-эа необходимости подрадя ивания микроорганизмов.
Цель изобретения †. уменьшение времени, т.е. ускорение определения . микроорганизмов.
30 раются на границе раздела фаз, следовательно, их количество на поверхности раздела фаз увеличивается, что позволяет исключить иэ анализа такую длительную стадию, как подращивание, а это, в свою очередь, приводит к увеличению скорости взаимодействия бактерий с солями тетразолия и появления видимой окраски. Таким образом, экспрессность достигается за счет использования в индикаторе двухфазной системы. Кроме того, образующиеся при восстановлении солей тетразолия формазаны нерастворимы в воде и остаются на разделе фаз, где находится биоматериал, вследствии чего появляющаяся на границе раздела фаэ окраска более контрастна и становится видной глазу наблюдателя раньше, чем при наблюдении того же явления в объеме жидкости. При увеличении объема пробы соответственно в 10 и 100 раз увеличивается чувствительность и соответственно уменьшается время анализа данной конкретной концентрации микроорганизмов за счет использования в качестве носителя концентрирующей двухфазной системы.
При изготовлении предлагаемого реагента для введения соли тетраэолия в систему ее растворяют в этиловом спирте, так как соли тетразолия плохо растворяются в воде, При этом на 0,01-0,05 вес,ч. соли берут 0,5 вес.ч. спирта, получая в реэультате 2-9%-ный спиртовой раствор. Данные количества являются необходимыми для обеспечения стабильности двухфазной системы реагента, проявления четкого окрашивания.
Оптимальные значения рН, при которых используется предлагаемый реагент, составляют 6,2-7,0, Этот реагент обеспечивает индикацию микроорганизмов в течение 1-200 мин, т.е. значительно быстрее,чем известный, используемый для этой цели.
Экспрессность достигается за счет концентрирования микроорганизмов в интерфаэе из объема жидкости и соответственно увеличения скорости появления окраски эа счет большего удельного количества микроорганизмов, Использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующей двухфазной системы позволяет исключить длительную стадию подращивания микроорганизмов.
Пример 1. В пробирку иа
25 мл сечением 1 см к 62,79 вес.ч.
t исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов,добавляют смесь, содержащую, вес,ч.: полиэтиленгликоль
ЖО : 20, трехэамещенный фосфат калия 17, иоднитротетразолий 0,01, растворенный в 0,5 вес.ч. этилового
1063835 спирта. Систему подкисляют фосфорной кислотой до рН 6,8. После разделения фаз (-1,5 мин) через 190 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. 5
Наличие. окраски указынает на присутствие микроорганизмов.
Пример 2. В пробирку по примеру 1 к 52,47 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую вес.ч ° : полиэтиленгликоль -400
25, трехзамещенный фосфат калия 22 иоднитротетразолий 0.003. раство- 15 ренный в 0,5 вес,ч. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 6,8.
После отстаивания (1-1,5 мин) через 0,2-40 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов н пробе) наблюдают за бкраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов.
Пример 3. В пробирку по примеру 1 к 41,45 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую, нес.ч,: полиэтиленгликоль — 400 30; трех- 30 замещенный фосфат калия 28; иоднитротетразолии 0,05, растворенный в
0,5 вес.ч. этилового спирта, подкйсляют систему фосфорной кислотой до рН 6,8. После разделения фаз З5 (1-1,5 мин) через 0,6-60 мин {в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микро-. организмов.
В табл. 1-3 дано время появления аналитического эффекта при определении иоднитротетразолий редуцирующей активности для аэробных микроорганизмов в зависимости от их вида и 45 концентрации в пробе (соответственно по примерам 1-3).
Из табл, 1-3 следует, что использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующих двухфазных 50 систем в сочетании с реагентом иоднитротетразолием позволяет проводить определение аэробных микроорганизмов в пробе в зависимости от их . вида и концентрации за 0,2-90 мин. 55 !
Пример 4. В пробирку по примеру 1 к 62,49 вес,ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный нид аэробных микроорганизмов, до
Ьанляют смесь, содержащую вес.ч.: по-ЬО лиэтиленгликоль — 400 20 трехзамещенный фосфат калия 17; тет
:разолий фиолетовый 0,01, растворенный в 0,5 вес.ч. этилового спирта, под кисляют систему фосфорной кислотой
65 до рН 7. После разделения фаз (11,5 мин) через 20-70 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов s пробе) наблюдают эа окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов.
Пример 5. В пробирку по примеру. 1 к Р2,47 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид.аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую, вec.ч.: полиэтиленгликоль-400 25; трехзамещенный фосфат калия 22; тетразолий фиолетовый 0,03, растворенный в
0,05 нес.ч. этилового спирта, подкис ляют систему фосфорной кислотой до рН 7. После отстаивания через 550 мин (в занисимости.от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе.
Наличие окраски указывает на при-. сутствие микроорганизмов.
Пример б, В пробирку по примеру 1 к 41,45 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую вес.ч.: полиэтиленгликоль-400 30; трехзамещенный фосфат калия 28, тетразолий фиолетовый — б,05, растворенный в
0,5 вес.ч.. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 7. После разделения фаз (11,5 мин) через 15-60 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов.
В табл. 4-6 по примерам 4- б соответственно дано время появления аналитического эффекта при определении редуцирующей активности тетразолий фиолетового для аэробных микроорганизмов в зависимости от их вида и концентрации в пробе.
Как видно из табл. 4-6, использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующих двухфазных систем н сочетании с реагентом— тетразолием фиолетовым позволяет проводить определение аэробных микроорганизмов .в пробе в зависимости от их вида и концентрации за 5-90 мин.
Пример 7. В пробирку по примеру 1 к 62,49 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую, вес.ч.: полиэтиленгликоль-400 20; трехзамещенный фосфат калия 17; неотетразолий хлорид 0,01, растворенный в
0,5 вес,ч. этилового спирта, под- кисляют систему фосфорной кислотой до рН 6,2. После разделения фаз (1-1,5 мин) через 5-200 мин (в за1063835
Т а бл и ц а 1
Состав двухфазной системы
Концен;трация микроорга низмов, кл/мл
Концентрация иоднитротетразолия хлорида, нес.ч.
Время появления визуально"наблюдаемой окраски, мин
Вид микроорганизмов рН
Концентрация, вес.ч. полиэтиленгликоля-400 трехзамещенного фосфата калия
1 10
105
0,01 6,8
Е. со 2i М17
1-3
1 10
1 10
$аг. Г1ача
0,3
1 105
1 10
1-2
15 висимости от вида и концентрации мик роорганизмов н пробе) наблюдают за окраской н интерфаэе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов.
Пример 8. В пробирку по примеру 1 к 52,47 нес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую нес;ч.: полиэтиленгликоль-400 25; трехэаме- 10 щенный фосфат калия 22 неотетразо лий хлорид 0,03, растворенный н
0,5 вес.ч. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 6,2. После отстаивания через 15
2-120 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов. 20
Пример 9. В пробирку по при.меру 1 к 41, 45 вес. ч ° исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь содержащую вес.ч.: полиэтиленгликоль-400 30, трехзамещенный фосфат калия 28, неотетраэолий хлорид 0,05, растворенный н
0,5 вес.ч. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 6,2. После разделения фаэ (11,5 мин) через 4-180 мин (н зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают эа окраской в интерфазе. Наличие окрас- ки указывает на присутствие микро- 35 организмов.
В табл. 7-9 показано время появления аналитического эффекта при определении редуцирующей активности неотетразолия хлорида для аэробных микроорганизмов в зависимости от их нида и концентрации в пробе (соотнетственно по примерам 7-9) .
Из табл. 7-9 следует, что использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующих двухфазных систем в сочетании с реагентомнеотетразолием хлоридом позволяет проводить определение аэробных микроорганизмов в пробе в зависимости от их вида и концентрации эа 2200 мин.
Предложенный индикатор позволяет сократить время проведения анализа на присутствие аэробных микроорганизмов н водной пробе до 0,2-200 мин (табл;1-2 ) по сравнению с прототипом (720-840 мин) за счет использования в индикаторе в качестве носителя концентрирующей двухфазной системы, что, в свою очередь, исключает длительную стадию подрашивания микроорганизмов. Индикатор не требует дальнейшей разработки и может быть применен в микробиологическом производстве, а также для анализа воды на загрязненность микроорганизмами, внедрение его не требует больших затрат и специального обучения.
Технико-экономическая эффективность изобретения заключается н ускорении определения микроорганизмов.
1063835
Продолжение табл. 1 вухфаэтемя
Концентрация иоднитротетраэолия хлори« да, вес.ч. рН рация, .ч.
1 106
1. 105
6,8 4 10
0.,01
1 10
1 10
5 104
8 ° 10
«
8 10
-Т а б л и ц а 2
Состав двухфазной системы рН трехзамещенного фос фата калия полиэтиленгликоля-400
1 10 0,2
1 10 1
22 0,03 6,8
1 10 10 .
1 10 0,3
1 10 0,5
1 .104
1 10
0,6
Вид микроорга
Sacch. cerevisiae
Bac. cereus
Вас. thuringiensis
Вид микроорганизмов
E.cori М17
Sar, f1ava
Sacch.cerevisiae трехэамещенного фосфата калия
Коцентрация, вес.ч.
Концентрация иоднитротетразолия хлорида вес.ч.
Концентрация микроорганизмов, кл/ип
Концентрация микроорганизмов, мл/мл
Вреья по" явления визуально"наблюдаемой окраски, мин
Время появления визуально наблюдаемой окраски, мин
1063835.родолжение табл. 2
° Ю ФЬ Ю Ю & Ю
Концентрация иоднитротетразолия хлорида вес.ч.
Состав двухфазной система@
Время появления визуально наблвдаемоЯ окраски, мин рН
Коцеитрация, вес.ч. по,пиэтилеигликоля-400
1 106
22 0,03 6 8 1- 10 10
1 10 1
1 10 5
5 10 30
Bac. cereus
8 ° 106 0,5
8 ° 10 2
8 10 40
Таблица 3
Состав двухфазной системы
Концентрация микроорганизмов кл/мл рН
Коцентрация, вес.ч. полизтиленгликоля-400 трехзамещенног фосфата калия
0,05 6,8 1.10 0,6
1 ° 10
1-2
E. cori M17
1 10 20
Sar. f1ava
1 ° 10 0,3
1 ° 10 1
1 104 10
1 10 1
110 4
0,05 6,8 4 ° 10 15
28
Вид мнкрооргани эмов
Вас, thuringiensis
Вид микроорганизмов
Sacch. cerevisiae трехэамещенного фос фата калия онценрация одниротетразолия лорида, вес.ч.
Концентрация микроорганизмов, мл/мл
Время появления визуально наблюдаемой окраски, мин
1063835
Продолжение табл.
» ««1»» фаэ»
Время появленияя виэуальио наблюдаемой окраски, мии
1 ° 10, 1,5
1 ° 10 10, 104 40
8 10. 1
8 10 3
8 10 60
Таблица4
Концентрация микроорганизмов, кг/мл
1 рН
1 10
20
0,01
1 10
1 10
1 ° 10
Sar. fLava
1 10
1 .104
10
1 10
«и»
1 105
4 .104
1 10 15
1 10 20
0,01 7
20
Bac. cereus
Вас, thur ingiensis
Вид микроорганизмов, е. со li М17
Sacch, cerevisiae
Вас. cereus трехамееииог фосфаа каИИ
Состав двухфазной системы
Концентрация, вес.ч. полиэти- трехзамеленгли- щенного коля-400 фосфата калия
Концентрация тетразолия фиолетового. вес.ч.
Коицеи« трация микроор» гаиизмов кл/мл
Время появления визуально на-блюдаемой окраски, мин
1063835
Продолжение табл, 4 рН
РЕХЗ &МЕщенного фосфата калия полиэъиленгликоля-400
15
8 10
8 104
Таблица 5 рН полиэтиленгликоля-400
1 10
25
0,03
15
1 104
1 106
1 105
1 10
1 10
1 105
4 104
22 0,03
10
Вид микроорганизмов
Бас. thuringiensis
Вид микроорганизмов
Г.cori М17
Sar, Грача
Sacch. cerevisiae
Вас. cereus состав двухф&эиОЙ системы
Концентрация, вес.ч.
Состав двухфазной системы
Концентрация, вес.ч. трехэамеценно
ro фосфата ха лия!
Концентрация тетраЭОЛИЯ фиолетоВОГО вес.ч °
Концентрация тетра. золия фиолетового, вес.ч.
Концентрация микроор» ганизмов, кг/мл
5. 104
8 ° 10
Концентрация микроорганиз мов,. кл/мл
1 106
1 106
5 10
Время появления визуально на-блюдаемой окраски, мин ремя ловления иэуальо наблюаемой краски, мин
1 б
1063835
Продолжение табл. 5
8 10
8 ° 10
1о
8 104
Таблицаб
° и рН трехэаме щенного фосфата калия полизтиленгликоля-400
1 10
1 10
0 05
30
60
110 7
1° . 10 1О
Sar . f lava
1 ° 10
10
50
10
15
5 10
8 ° 106
8 10
15
8 10
Вас. thuringieusis
Вид микроорганизмов е. соЬ М17
Sacch cerevisiae
Bac. cereus
Bac. thuringiensis
Состав двухфазной системы
Концентрация, вес.ч.
Концентрация тетразолия фиолетового вес.ч.
0,05 7
Концентрация микроор ганизмов, кл/мл
1 10
1 10
4 10 ремя роявлеия виуальо наблюаемой краски, мин
1063835
18
Табл ица7
Состав двухфазной системы
Концентрация микроорганизмов кл/мл
Концентрация, вес.ч. рн трехзаме щенного фосфата калия полиэтиленгликоля-400
1 10
1 10
120
120
1, 104
120
1 10 а.
1 10
1 .104
6,2
0,01
20
1 106
200
1 10
4 10
200
200
200
200
200
Таблица 8
Концентрация микроорганизмов кл/мп ремя повления изуально аблюдаемой окраси, мин
Концентрация нес тетразолия хлорида,, вес ° ч, рН трехзаме щенного фосфата калия полиэтиленгликоля-400
1 ° 10
1 10
6,2
0,03
25
1 10
Вид микроорганизмов
Е. cori M17
Sar. fiava
Sacch. cerevisiae
Вас. cereus
Вас. thuringiensis
Вид микроорганизмов
Е,cori М17
Состав двухфазной системы
Концентрация, вес.ч. онцентрация неотетраэолия хлорида, вес.ч.
0,01 6,2
1 10
1 10
1 10
8 10
8 ° 10
8 10 ремя появления визуально наблюдаемой окраски, мин
1063835
1 ° 106
8О
Bar . f3ava
1 105
1 10 .80
1.1о6
1-10
4 10
1О
22 0,03
6,2
1.10 120
1 10 120
5 10 120
8 1о6 12о
8 106 120
8 10 120
Таблица9
Концентрация микроорганизмов кл/мл рН полиэтиленгликоля-400 трехзамещенного фосфата калия
0,05
30
1 ° 1о5
1 10
1 10 100
1о6 1оо
1 10 100
Яаг.f3fava
Sac ch . cerevi в iae
Вв,.с. cereus
Bac. thuringiensis
В
Вид микроорганизмов
Е, соЯх М17
Состав двухфазной системы
Концентрация, вес.ч.
Концен трация неотетразолия хлорида, вес.ч.
6,2 1-10 ремя повления изуальо наблюаемой краски мин
1063835!
Продолжение табл.9
8acch.cerevisiae
1 10
6,2
1 ЪО
30
0,05
4 .10
15 Вас. cereus
Вас. thuringiensis
8 10 180
Составитель О, Скородумова
Редактор И. Ковальчук ТехредЛ.Микеш Корректор A,Ïoâõ
Заказ 10472/27 Тираж 523 Подписное
БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4
1 10 180
1-10 180
1 10 180
8 106 180
8 10 180