Способ определения чувствительности лимфоцитов к левамизолу

Способ определения чувствительности лимфоцитов к левамизолу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИTE .FH HOCTH ЛЮЙФСЩИТОВ К ЛЕВАМИЗОЛУ. включающий двухэтапное инкубирование лимфоцитов , о аботанных яевамиэолом с эритроцитами барана, центрифугирование и подсчет Е-розеткообразующих клеток, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, центрифугирование осуществляют после первого этапа инкубации ЛИМФОШ4ТОВ, обработанных левамизолом с: эритроцитами барана, причем левамизол берут в концентрации 0,01 мкг/мл среды, содержащей ilO лимфоцитов.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И) А

3151). А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3389688/28-13 (22) 04.02.82 (46) 07.01.84. Бюл. Р 1 (72) В. Е. Казмирчук, Н. Г. Бычкова, А . А. Андрушук. Э. В. Гюллинг и Г. П. Кравчук (71) Киевский ордена Трудового Красного:

Знамени медицинский институт им; акад.

А. А. Богомольца (53) 615;375 (088.8) (56) I..Goldstein А. 1, Вага О.. W., et аИ

"First clinical trial. with thymozin reconti—

tution of Т-cells in patiens with cellular

immunodefis. Тгапвр1 ют. Proc. — 1976, v. 7, р. 681-686. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ,ЛИМФОЦИТОВ К ЛЕВАМИЗОЛУ, включающий двухэтапное инкубирование лимфоцитов, обработанных левамиэолом с эритроцитами барана, центрифугирование и подсчет

E-розеткообразующих клеток, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, центрифутнрование осуществляют после первого этапа инкубации лимфоцитов, обработанных левамизолом c .. эритроцитами барана, причем левамнзол берут в концентрации 0,01 мкг/мл среды, содержа- щей 1 ° 10 лимфоцнтов.

1064952 2

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии.

Известен способ определения чувствитель° ности лимфоцитов к иммуномодуляторам (тимозину), включающий двухэтапное инкубирование лимфоцитов, обработанных иммуномодуляторфм с эритроцитами барана, центрифугирование. и подсчет Е-роэеткообразующих клеток 11).

Однако известный способ недостаточно чув- 10 стви тел ел.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа, включающего двух- 15 этапное инкубирование лимфоцитов, обработанных левомизолом с эритроцитами барана, центрифугирование и подсчет Е-розеткообразуюших клеток, центрифугирование осуществляют после первого этапа инкубацни лимфоци- 20 тов, обработанных левамизолом с эритроцитами барана, причем левамизол берут в концентрации 0,01 мкг/мл среды, содержащей

1 10 лимфоцитов.

Способ осуществляют следующим образом. 25

Берут 0,1 — 0,2 мл крови из пальца, выделяют 1 10 лимфоцитов для двух проб.

Лимфоциты одной из проб обрабатывают иммуномодулятором (например, 0,01 мкг левамизола в 0,1 мл среды 199) и инкубируют один час при 37 С.

Постановку реакции E-розеткообразования проводят путем пятиминутного центрифугирования смеси суспензии лимфоцнтов с 0,4%-ной взвесью эритроцитов барана (соотношение

1;90) и двухэтапной инкубацией: 30 мин в термостате при 37 С и 18 — 20 ч в холодильнике при +10 С.

Стимулирующий эффект иммуномодулятора (например, левамизола) определяют по разности процентного содержания Е-розеткообразующих клеток, стимулированных иммуно. модулятором (например, левамизолом), и спонтанных.

Пример.

1. Выделение лимфоцитов.

Кровь берут из пальца утром в одно и тоже время в количестве 0,1 — 0,2 мл в силнконированную пробирку, содержащую 0,1 мл гепарина (25 ед. гепарина в l мл физиологи50 . ческого раствора). Взятую кровь разводят средой 199 в 2 раза и наслаивают на 0,5—

1 мл смеси фиколуротраст (фикол-верографин) — плотность раствора 1,077 г/мл. Центрифугнруют 30 мин при 400 q в центрифуге с угловым ротором. Снимают белое кольцо (выделенная взвесь лнмфоцитов) с интерфазной поверхности в чистую пробирку, отмывают средой 199 трн раза в течение 10 мин при 200 q, затем проверяют жизнеспособность выделенных лимфоцитов ло суправитальной окраске с трипановым синим и производят подсчет лимфоцитов в 1 мл.

2. Обработка. лимфоцитов левамизолом.

К 0,1 — 0,2 мл взвеси лимфоцитов прибавляют 0,01 мкг левамизола в 0,1 мл среды

199, инкубируют 1 ч при 37 С в термостате, центрифугируют 5 мин при 200 q и с осадком ставят реакцию E- розеткообразования.

3. Постановка реакции E-розеткообразования.

Реакцию ставят параллельно с двумя пробами лимфоцитов: чистой взвесью и с обработанными иммуномодулятором (например, левамнзолом). К 0,1 мл суспензии лимфоцитов прибавляют 0,1 мл среды 199 н 0,1 мл

0,4%-ной взвеси эритроцитов барана (соотношение 1:90). Смесь центрифугируют в течение 5 мин при 200 q, выдерживают в термостате при 37 С 30 мин и оставляют на ночь (на 18 — 20 ч) при -10 С.

На следующий день осадок осторожно ресуспендируют и производят подсчет в камере

Горяева 200 лимфоцитов, вычисляют процент клеток, образовавших розетки не менее, чем с четырьмя эритроцитами барана.

4. Иммуностимулирующий эффект левамиэола оценивают по разности процентного содержания розеткообразующих клеток в пробах с иммуномодулятором и беэ него.

Данные исследования чувствительности лимфоцитов (in vitro) к синтетическому (левамизолу) и естественному (тимозину) иммуномодуляторам представлены в табл. 1. Установлено, что наиболее оптимальной концентрацией яевамизола при иСследовании чувствительности к ним лимфоцитов(!и vitro) является

0,01 мкг/мл (0,005 — 0,05 мкг/мл) тимозина—

100 мкг/мл согласно предлагаемому способу (табл. 1). Показана более высокая достовер. ность различий в числе Е-роэеткообразующих клеток дс и после обработки иммуномодулятором при использовании предлагаемого способа. Количество больших розеток (т.е. присоединивших 9 и более эритроцитов) достоверно выше при использовании предлагаемого способа, что позволяет повысить чувствительность метода и точность подсчета результатов.

1064952

3 4

Таблица 1

Эффективность влияния различных доз левамизолаи тимозина на количество Е-розеткообразующих клеток у детей с частыми распираторными заболеваниями согласно известному и предлагаемому способам

Среда 199 (контроль) 19,2 .1,02

39,1

1,98

5,6

101

38,8

1,72

Лева мизол (оптимальная концентрация по известному способу) 1 10

7,1

1,10

22

> 0,05

50,2

3,19

22

<005

Р

-m

5 10"

13,6

1,08

55,3

5,26

< 0001

7 0,05

< 0,05

< 0001

<0005

< 0,01

Г г2

1 ° 10" М

14,1

1,12

Левами зол

56,1

4,15

48,8

l,09

60,1

2,02

22 по предлагаемому способу оптимальная + m концентрация и

< 001

Р, Р2

< О,ОО1 .>005

< 0,001 .< 0001

< 0,01

58,6

2,26

22

<О001

5 10"

419

2,13

22

< 0,001

< 0,001

14,6

2,07

22

< ОО1

59,9

2,12

22

-< 0,001

> 0,05 и

Р

Р2

52,2

4,72

< 0,05

58,1

1,82

< 0,001

> 0,05

37,5

2,26

10 (001

< 0,001

104

1,09

< 0,05

10 и

2

М

50,94,12

10 (0,01

10,9

1,11

< 005

Тнмозин по

100 tl

Оп.им ьная Р, концентрация Р2

М предлагаемому

;по собу

13,8

1,28

l0 (001

57,3

4,01

< 001

1000 и

П р н м е ч а н и е. Р— достоверность различий по сравнению с контролем, Pg — достоверность различий.по сравнению с ранее известным способом.

54,3

2,14

22.

< 001

>005

59,9 2,06

59,8

2,13

10 (ÎÎÎ1

< 005 57,2

2,82

< 0,001

> 0,05

29,2

1,1 l

22.<001. <001

42,0

1,89

47,2

1,14

< О,ОО1

C 0,001

40,4

1,19

10 с 0,001 с 0,001

1064952 инкубация, центрифугирование, инкубация; при такой последовательности действий 5 образуется меньше розеток, особенно больших. но предлагаемому: .

Предлагаемый способ (Т = -10 С) 10

27

15

60

55,3

48

Составитель Г. Крюкова

Техред С.Мигунова

Корректор Л. Патай

Редактор С. Тимохина

Подписное

Тираж 689

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и. открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 10918/4

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4

Изменение последовательности совершаемых действий по известному способу;

Известный способ (Т=-4 С) Температура -10 С является оптимальной для процесса розеткообразования, так как при ней образуется максимальное количество

Š— РОК, особенно больших.

Преимущество использования 0 4%-ной взвеси эритроцнтов барана: согласно известному способу

50 ° 10 (500 10 )

1: 5; центрифугирование, инкубация; при такой последовательности действий образуется значительно большее количество розеток, особенно больших.

Данные, подтверждающие оптимальность температурного режима согласно предлагаемому способу, представлены в табл. 2.

Таблица 2

I согласно предлагаемому способу

90 10 (900 10 )

1: 90.

Соотношение 1:90 обеспечивает оптимальный эффект роэеткообразования.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность способа в

2 — 3 раза, а кроме того, позволяет сэкономить в 10 раз количество дорогостоящих реактивов и иммуномодулятора.