Способ резекции предстательной железы

Способ резекции предстательной железы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

g g А 61 В !О/00, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3376483/30-15 (22) 04.01.82 (46) 15.01.84. Бюл. ¹ 2 (72) Е, l3 Мельников, В. A. Дриняев, В. А. Яшин, В. Н. Карнаухов и В. К. Утешен (7! ) Институт биологической физики AH

СССР (53) 591.32 (088.8) (56) !. Shea В. F. et а!.— In: -«Fgg Transfer

in Cat tie Se>ninar С. Е. С.», Luxeml>urg

Eur.,54Ч, 1976, р. 145 — 152.

2. Brinster В. L. Expor Cell. Res., 1963, 32. 205 — -207.

3. Nohr L. et al. The use of fluorescein

diacetatc to asses eml>rgo ч(>а!>1!11у in the

mouse.— «!. Reprod.and Fert.», 1980. 58, ¹ 1, р. !89 — 196.

„,Я0„„1066552 A (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСП ОСОБН ОСТИ Я Й ЦЕ КЛ ЕТОК И ЗАРО.

ДЫ Ш ЕЙ МЛ Е КОП HTA ЮШИХ, включаю. щий их ннкубаьню в синтетической питательной среде с флуорохромом и последующий анализ окран>енных яйцеклеток и аа. родышей с помощью микроскопического исследования, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и снижения токсичного действия флуорохрома, в ха. честве флуорохрома используют 8-анилино-1-нафталено-8-сульфат илн 2,7-диа,>ино-l0-атил-9-фенилфенонтридиумбромид.

1Обб552

Изобретение относится к экспериментальной гинекологии и ветеринарии и предназначено для проведения эмбриологических и криобиологических исследований. Кроме того, оно может найти применение в животноводстве, в частности для определения жизнеспособности трансплантируемых зародышей.

Известен способ определения жизнеспособности дробящихся зародышей млекопитакнцих, основанный на оценке морфологического состояния, заключающийся в том, что путем прижизненной микроскопии оценивают морфологическое состояние дробяшихся зародышей по пятибальной системе, где учитывается их компактность, симметричность и плотность (! ).

Недостатком известного способа является его малая точность, поскольку отсутсгн ует строга я коореля ци я между оцен иваемыми морфологическими признаками и жизнеспособностью зародышей. Как показала практика, часто низкооцененные группы зародышей оказывались жизнеспособными.

Известен также способ определения жизнеспособности оплодотворенных яйцеклсток и дробящихся зародышей путем прижизненной микроскопии после их культивирования в синтетической питательной среде. Этот способ заключается в том, что в асептических условиях под слой специальным образом подготовленного биологически инертного вещества, не смешивающегося с водой (вазели нового или силиконового масла), находящегося в чашке Петри, вносят микрокаплю синтетической питательной среды и затем в нее помещают около !О зародышей или оплодотворенных яйцеклеток. Чашку

Петри переносят в систему, обеспечивапощую поддержание в газовой фазе над биологически инертным веществом 5 — 10% СО при 37 С, и заполняют систему смесью газов, содержащей 5 — f0% СО . Оплодотворенные яйцеклетки культивируют в течение Рб ч, а дробящиеся зародыши млекопитающих в зависимости от стадии развития — в течение 24 — 72 ч. После культивирования методом прижизненной микроскопии оценивают стадию развитяя. Жизнеспособными считают те зародыши и оплодотворенные яйцеклетки, которые за время культивирования достигли стадии бластоцисты (2).

Однако этот способ нельзя применить для определения жизнеспособности в двух стадиях зародышевого развития -- неоплодотворенная яйцеклетка (поскольку она не может дробиться) и поздняя бл астоциста (так как в этой стадии зародыш уже необходимо трансплантировать в матку). Способ нельзя использовать перед проведением воздействий па яйцеклетки и дробящиеся зародыши. Кроме того, способ неточен н силу способности частью зародышей имитировать в ходе культивирования процесс

50 этом жизнеспособными считаются клетки, не обладающие флуоресцентным свечением, а жизнеспособными — обладающие им (3).

Одним из недостатков этого способа является его малая точность, обусловленная тем, что с его помощью определяется наличие активных эстеразных ферментов в клетке, которое является необходимым, но не достаточным условием жизнеспособности клеток. Так, фрагментируюц иеся яйцеклетки, т. е. яйцеклетки заведомо нежизнеспособные, поскольку они не были оплодотворены, определялись с помощью метода с использованием ФДА как жизнеспособные, хотя образование флуоресцеина внутри клеток являлось лишь свидетельством активности их эстеразных ферментов, а сами фрагментирующиеся яйцеклетки были обречены на гибель. Кроме того, показано, что некоторые дробящиеся зародыши, подвергавшиеся процедуре замораживания оттаивания и определенные по способу с применением ФДА как жизнеспособные, иодробления путем фрагментации цитоплаз мы, в особенности тех зародышей, для получения которых применяют метод гормональной суперовуляции (Frank G. P . Aging

of mouse in vivo and in vitro,9cunete Res., 1980, 3, № 4, 379-393). Наконец, этот способ представляет собой длительный и трудоемкий процесс, занимающий до 96 ч.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ !

О экспресс-определения жизнеспособности яйцеклеток и дробящихся зародышей млекопитающих с использованием флуоресцеиндиацетата (ФДА). Этот способ основан на свойстве ФДА, представляющего собой ненолярное нелюминесцируюгцее вещество, легко проникать через клеточную мембрану и под действием эстеразных ферментов превращаться во флуоресцеин — - вещество, имеющее высокий квантовый выход флуоресценции. Образование флуоресцеина из ФДА внутри клетки или зародыша свидетельствует, таким образом, о наличии в них активных эстеразных ферментов, что является необходимым условием их жизнеспособности.

Этот способ состоит в том, что дробящие25 ся зародыши или яйцеклетки помещают в каплю свежеприготовленного физиоло ически сбалансированного солевогo раствора, содержащего 10 М ФДА и инкубируют 1 мин при комнатной температуре (18 ——

25 C!. Затем 1 мин дробящиеся зародыши и яйцеклетки отмывают от ФДА свежими порциями указанного раствора (для удаления флюоресцеина, образующегося в межклеточной среде и мешающего наблюдению самих клеток). Затем в капле этой среды их микроскопируют в проходящем свете и свете лю- . минесценции и по появлению излучения флуоресцеина в яйцеклетках или дробящихся зародышах судят об их жизнеспособности. При

10бб552 скольку обладали флуоресценцией, имели явно выраженные летальные морфологические повреждения.

Другим недостатком метода с применением ФДА является то, что он основан на вмешательстве в жизнедеятельность жизнеспособных клеток и зародышей, так как жизнеспособность определяется по одному из продуктов химической реакции, происходящей внутри клетки, причем в этой рсаКции участвуют эндогенные ферменты, играю(цие определенную роль в ее жизнедеятепьности, а продукты реакции остаются внутри клетки и также могут влиять на ее жизнедеятел ьность и на получаемое потомство.

Кроме того, способ с использование ФДА требует от мы вки, которая занимает 30 /() о !5 времени всей процедуры определения. . Цель изобретения — повышение точности способа и снижение токсического действия флуорохрома.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения жизнеспособности яйцсклсток и зародышей млекопитающих, включак)щему их инкубацию в синтетической питательной среде с флуорохромом и последующий анализ окрашенных яйцеклеток и зародышей с помощью чик!)оскопичсск()гo исследования, в качестве флуорохрома используют 8-анилино-1-нафталеНо-сульфат или 2,7-днам ино-!0-этил-9-фенилфснондиумбромид.

Пример /. Опрсдслснис жизнеспособности ийlkскл "! oк и д1)()бя(I(их(. H зарo7ы— шсй после низкотсмисратър(ц)й консерваIjи и и xpа (((. и и я их ((p и т(. M II(. p(!Т) р(. >HI!дкого азота.

Дсконссрвированныс и омытые от крио1I p OT (. K T() p a H H 1! C h. 1 C T K k1 и (p O() H I I (I 1 C C rl 3 ародыши мл Ko(IHTBK)lllHx номсща IH в капл!о среды Хенк d, содержап(укэ 1-анили(ю-нафта лсно-8-сульфат (или 2,7-диамино-! 0-этил-9-фен ил-фснонтридиумбромида) в концентрации 10 - 10 М, выдерживали 2 мнн

1 при комнатной температуре, просматрива- 40 ли их с помощьк) люминисцентного микроскопа в проходящем свете и свете люминесценции 10 с и выявляли яйцеклетки и заРОДЫП!И, НЕ ИМЕЮЩИЕ !OMAH)ICC(feIITf!O(O СВСчения, которые определяли как жизнеспособныее.

Отобранные таким образом жизнеспособныс зародыши подвергали культивированию, которое показало, что 100О/р их нормально развивается до стадии бластоцисты.

При культивировании яйцеклеток и зародышей, отобранных в качестве жизнеспособных по известному способу, только примерно 5+/() развивалось до стадии бластоцисты и, таким образом, около 50О/о объектов со скрытыми повреждениями оказались ошибочно определенным и как я(изнес пособи ые у по известному способу. Более того, даже

1 яйцеклетки и зародыши, имевшие явно выраженные морфологические летательные повреждения, ошибочно определялись по известному способу как жизнеспособныс.

Таким образом, применение предлагаемого способа позволило примерно в два раза повысить точность определения жизнеспособности яйцеклеток и дробящихся зародышей после их криоконсервации по сравнению с известным способом.

Пример 2. Определение жизнеспособности. оплодотворенных яйцеклеток и дробящихся зародышей млекопитающих перед трансплантацией приемным матерям.

Оплодотворенные яйцеклетки или дробящиеся зародьцци млекопитающих непосред. ственно перед проведением трансплантации соответственно в яйцевод или матку помещали в каплю среды Хенкса, содержащую

2,7-диамино-! 0-этил-9-фснилфснонтридиумбромид (или -анилино-нафтален-8-сульфат) в ко((счной KoHLlcllTpfllll(H 10 — 10 М и вы-5 6 дср>кивали м(111 при комнатной тсмпсратурс. Затем полу !с((ный препарат просматривали в люминссцснтном микроскопе в проходящем свстс и свете люминесценции в течение 10 с и выявляли яйцеклетки и или зародыши, нс имсюи(ис люминесцентногo свечсн(IH, которыс 0((рсд(.(Ялп как жизнсспособныс и испо7ьз(э(3 ).7è для трансплантации.

Дальнейшее наблюдснис показа lo нормальное развитис от()бранных яйцсклсток и зародl llllc."(. Прп этом 10 p яйцсклеток и/или дробящихся зароды(пей отбраковывается как нсж изнсспособныс. Хотя известный способ в этих случаях позволяет отбраковывать как нсжизнсспособныс пример!ю такое жс количество яйцсклсток н зародышей, как и предлагаемый, однако известный способ имсст тот IIc <-ocT(IT()K, что внутри определенных как нсжнзн(способные яйцеклеток и зародышей остаютсH чужеродные для клеток продукты реакции ФДЛ, которые могут в дальнсйн(см повлиять на развитие самих яйцсклсток и/или зародышей и на потомство из IHIx. Прсдлагаемый способ лишен .этого нсдос(f(r K a.

77рпз(ср, ). Выявление неж из неспособности фра(мснтирующпх яйцеклеток.

Завсдомо нежизнеспособные фрагментирующисся яйцеклетки помещали в каплю среды Хснкса, содержащую 2,7-диамино-10-этил-9-фснп.:!(!)с((()нтридиумбромида (или

1-а((и Iи(l()-нафта.7с((о-8-сульфата) в концентрации 10 --10 М, выдерживали 1 мин при комнатной тсмпсратурс, просматривали их с помо(цьк) IH)IH(lccll(нтного микроскопа в И1)оходящсм свете и свете люминесценции I! в 100 /() случаев выявляли нежизнеспособность этих яйцеклеток по наличию их люми((ссцеIITHoco свечения в отличие от ре3Х 7bTaTOf3, IIO7X IaCXI(>IX H3BCCTHbI5(способом, котор((1!.оп(ибо !!(о о((рсделяет все 100О/р этих заведомо нсжи 3»(способных яйцекзеток©как жизнсспособньц ., жизнеспособных яйцеклеток и зародышей и потому перед трансплантацией их животному — реципиенту необходимо провести жесткую процедуру отмывки их от внутриклеточного красителя. Такая отмывка от внутриклеточного красителя клеток, полученных по известному способу, занимает

2 ч при 37 С и приводит к резкому увеличению длительности анализа и неконтролируемому повре ждению 60 — 80"/о яйцеклеток и зародышей, определенных как жизнеспособные по известному способу. Это приводит к низкой (20 — 30о/0) приживляемости с последующим развитием в организме животных — реципиентов зародышей и яйцеклеток, определенных как жизнеспособные по известному способу.

Наконец, предлагаемый способ благодаря применению красителей с переменным квантовым выходом не требует дополнительной операции отмывки клеток от внеклеточного флуорохрома, мешающего в известном способе наблюдению яйцеклеток и зародышей с BoMowblo люминесцентного микроскопа. Эта операция включает в себя отбор с помощью микроиипетки иод бинокулярным микроскопом каждого анализируемс го объекта, помещение его в синтетическую питательную среду для отмывки и затем снова под люминесцентный микроскоп для анализа на жизнеспособность. Г1роцесс отмывания, необходимый согласно известному способу, занимает не менее мин и становится особенно длительным при массовом анализе объектов. При осуществлении этого процесса согласно известному способу иовреждак>тся до 15 — 20% клеток уже после того, как они прореагировали с красите.1ем .(ФЛ,А), и потому эти повре>кденные клетки по известному способу ошибочно определян>т ся как жизнеспособные.

"1066552

Таким образом, использование, Оредлагаемого способа в сравнении с известным обеспечивает следующие преимущества.

Повышение точности определения жизнеспособности. Как видно иэ примера 3, благодаря применению специально подобранных красителей, особым образом взаимодействующих с мембраной яйцеклеток и зародышей, предлагаемый способ, в отличие от известного, позволяет определить нежизнеспособность фрагментирующихся 10 яйцеклеток (т. е. имитирующих процесс дробления путем фрагментации цитоилазмы). Кроме того, как видно из примера l, предлагаемый способ позволяет более точно определить жизнеспособность.зародышей, 1тодвергавшихся процедуре эаморажива- 15 ния — - оттаивания в процессе криоконсервации, в то время как известным способом определяли как жизнеспособные даже зародыши, имевшие явно выраженнь1е летальные морфологические повреждения.

20 .значительное понижение вредного влияния тестирующего вещества иа анализируемые яйцеклетки и зародьпии. поскольку ис-. пользуемые в предлагаемом способе флуорохромы практически не проникают в жизне способную клетку за время проведения ана- 25 лиза (1 — 3 мин). Это позволяет исключить возможность иовреждаюгцего влияния тестирующего вегцества как «а объект анали эа, так и на отдаленное его потомство.

Исключение проникновения красителей внутрь жизнеспособных клеток является важным преимуществом предлагаемого нами способа, так как определенные с его помогцью как жизнеспособные яйцеклетки и зародыши могут быть сразу же использованы для трансплантации животному рециииенту, в отличие оТ известного способа, в котором краситель проникает внутрь

Составитель A. Макаров

Редактор М. Циткина Техред И. Верес Корректор М. Шароши

Заказ 10844/5 Тираж б93 Подгп ное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изоеретений и открытий

113035, Москва, >К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4