Способ получения бактериальной биомассы

Способ получения бактериальной биомассы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЫ ИАЛЬНОЙ БИЮМАССЫ путем выращивания культу-. jH iThtobacillusThiooxidans58R иа питательной среде, включающей ,; 5Н2О, КНзРО, NH|CI и , в аэробных условиях, о тличаюшиися тем, что, с целью повышения выхода биомассы, процесс ведут в проточном режиме при сморости разбавления 0,1-0,15 на среде, даяюлнительно сод шшщей , HjBOU, FeCb л6Н,р, . 7HjO, , СоОй.. ( Си$Оц,. N82HPC|y 12H{p, «при следующем соотоошенш ингредвентов, г/л вошл: 8-12 Ма2&зОз-5Н,0 1,8-2,2 КМ,ТО4 0,8-1,2 Na2HPO4 12HiO 0,4-0,6 NN4 0,09-0,1 МдаабНаО ( 19-21).10, CeClj iO . -3 ( 2,5-3,0). 10-FeCls- 6HjO ( 0,70-,75) «10 ZnSO47HjO ( 0,5-0,6)- lO- MnS044H2O S ( 0,)-If НэВОз ( 0,2-ОЛ- lO, (NH4)lMoO4 ( 0,13-0,17) «lO GuSO4«5H2O

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 3(5„С 12 Н1/20;С12 а1/07

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTQPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР "

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3316712/28-13 (25) 3413856/28-13 (22) 10.07.81 (46) 15.01.84. Бюл. и 2 (72) М. Э. Xara, П. Ч. Микельсаар,А.А.Аави . саар и Х. Э. Арукаеву (71) Институт химической и биологической физики АН Эстонской ССР (53) 576.809.53 (088.8) (56) 1. Collins V. G. Methods Microbiology, 1969, Ч. ЗВ, $1-52.

2. Xara М. Э. и др. Синтез О-рибулозо-1,5° дифосфата иммобилизованной ферментной системой тионовых бакте1лй. — "Прикладная биохимия и микробиология", 1979, т. ХУ, вып. 5, с. 686-692. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ БИОМАССЫ путем выращивания культу-. ры 1Ъ(оЬаеП 1на Thiooxidans 58В на питательной среде, включающей N S<0> 5Н О, 1СЯ Щ, ИН О и МдС1/6Н О, в аэробных условиях, о тличающийся тем,что,сцельюпо-. вышения выхода биомассы, процесс ведут впроточном режиме при сюрости разбавления .0,1-0,15 sa среде, дополнительно содержащей

СаС1 - 4Н О, И ВО, РаС1г, бйаО, ZnSO g

7НаО, ВЬ80, - 40 0, СОС1, (ЙН4) МОЮ, Си801 5Н О, ИааНЩ 12Н<О, ари следующем соотнощении ингредиентов, r/ë воды:

1чаг8гОз 5НгG 8 — 12

КНг РО, 1,8 — 2,2

Иаг ИРОЙ, ° 12НгО 0,8-1,2

ИН С1 0,4-0,6

M0Cl бя О 0,09-0,1

СаС1г 4НгО . (19-21) -10 г.еС1з бНгО (2,5 — 3,0). 10

Ъв804 78гО (0,70- О,75) 10

NnS0 4НгО (0,5-0,6) 10 В Я

Нз ВОз (Ою25-0,35) ИГ (W4) г Мо04 . (Орг-ОрЗ). 10

СивО1 5НгО (0,13-0 17) 10

СоС1г (0.09- .1 1) -10 и процесс ведут при аэрации воздухом, обога- ф щенным СОг до концентрации 6-8%.

1067038

Изобретение относится к получению бактериальной биомассы путем выращивания тионовых бактерий, в частности штамма Thiobacil- па thiooxidans 58R, применяемого в качестве источника ферментов при синтезе биологически активного вещества D-рибулозо-1,5-дифосфата. йолучение О-рибулозо-1,5-дифосфата иэ

Р-рибозо-5-фосфата и аденозин-5 -трифосфата (АТФ) протекает в две стадии с участйем l0 ферментдв рибозофосфатизомеразы (О-рибоэо-5-фосфат-кетол-нзомераза, КФ 5.3.1.6) и фосфорибулокиназы (АТФ: 0-рибулозо-5-фосфат-1-фосфаттрансфераэа, КФ 2.7.119). В клетках тионовых бактерий ThlobacIIIua 15

ФЬьхЫапа 58 R! активности указанных фермен- . тов достаточно высоки и бесклеточный экстракт бактерий можно применять для проведения синтеза в промышленном масштабе. Кроме того в клетках названных тионовых бак- 20 терий отсутствуют фосфатазы, которые гидролизуют-эфиры фосфорной кислоты.

Тионовые бактерии Thiobacillus ЬюохЫапа

58 R являются антотрофиыми организмами, ко- торые используют в качестве источника энер- . 5 гии соединения серы, а все органические вещества синтезируют иэ углекислого газа, присутствующего в воздухе аэрации.

Известен способ получения бактериальной биомассы путем выращнвания тионовых бакте-30 .рий группы ТЫаЬас1Ниа на среде, содержащей микроэлементы. Нрнменекие в этом способе среды выращивания тионовых бактерий с содержанием растворенных в дистиллированной воде микроэлементов в следующих концентрациях, мг/л: NeCI 300; HiCI 0021;

CuS04 ° 5Нг О Чэ081 ZnS04 7Нг О 0,106;

НэВОг 0,6; Alq(80<)z 0,123; NiClq6HqO

0,11, Со804 7НгО 0,109 ТЮ4 0,06 KSr

0,03; KJ 0,03; MgCI, ° 4НгО 140, MnSOq 4 х7НгО 0,629; SnCIg 2НгО 0,036; Ре804к

Х7НгО 0,3 не обеспечивает достаточно высокой урожайности биомассы культуры (11.

Наиболее близким к предлагаемому по

:технической сущности и достигаемому резуль тату является способ получения бактериальt . rt

:ной биомассы путем выращивания культуры

ThIobaciHus МоохЫапв 58 В на питательной среде, содержащей.в 1 л водопроводной воды,.г: йагВгОз 5НгО 5; СаКР04 5; ййаО

0,5; МцС1гбИгО 0,1; КНгИ4 3,0 в аэробЯ ных условиях. Процесс ведут в периодической культуре с непрерывной аэрацией (обычно — с интенсивностью.-2 мз/ч в 20-литровых бутыпях в течение 4-5 cyr при комнатной температуре). Клетки бактерий выделяют иэ культуральной жидкости центрифугированием. Выход сырой биомассы О,5-0,8 г с 10 л культуральной жидкости f2j.

8 — 12

1,8 — 2,2

0,8 — 1,2

0,4-0,6

0,09 — 0,1 (19 — 21) .10 (2,5-3 0) . 10 (0,70 — 0,75) 10 (0,5 — 0,6) ° 10 Э (0,25 — 0,35) - 10 (0,2 — 0,3) 10 (0,13 — 0,17) ° 10 (0,09 — 0,11) " 10 йаг8гОг 5НгО

Кнгро4

ЬЬг НРОю 12Нг О

NH Ci

MgClg- 6НгО

Сас1 4Н О

FeCIq- 6НгО

ZnS0 ° 7Нг О

MnS04 4Нг О

Нз ВОз (NHq) г Мо04

CuS04 5Нг О

СоС1г и процесс ведут при азрапии воздухом, обогащенным СОг до концентрации 6 — 8%.

Способ осуществляется следующим образом.

Выращивание проводится в ферментере в проточном режиме с непрерывной аэрацией при рН 3,2 в среде указанного состава. Про- дувание воздуха, обогащенного углекислым газом (не более.чем 10%), проводят со скоростью, обеспечивающей концентрацию кисло- рода в культууальной жидкости и пределах

10-20% от насыщения, рй культуральной жидкости поддерживают автоматически при помощи 1 М раствора карбоната калия, равным 3,2. Темпеувтура вьгращивания бактерий 28 С. Скорость разбавления в проточном режиме, т.е. соотношение потока питатеяьной среды в час и общего обьема культуральиой жндкоети в ферментере, находится в пределах 0,1-0,15. Скорость перемешивани 100- 00 об/,.

Интенсивный рост бактерий характеризуется концентрацией кислорода 10 — 20% от насыщения, постоянным расходом раствора карбоната калия и оптической плотностью культуры 0,38-0,41 при 540 нм.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием. Выход сырой биоНедостатком известного способа является низкая урожайность бактериальной культуры, т.е. недостаточно высокий выход биомассы.

Цель изобретения — повышение выхода биомассы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения бактериальной биомассы путем выращивания культуры ThiobacilЬа thiooxidans 58 R на питательнон среде, включающей йаг8гОг 5НгО; КНгРО4, NH4CI и MgCIq 6НгО, в аэробных условиях, процесс ведут в проточном режиме при скорости разбавления 0,1-0,15 на среде, дополнительно содержащей СаС1г 4НгО, НгВО„ РеС1, ° 6Н, О, Zn804 ° 7Н, О, MnS04 4Н, О, CoCIq, (NH4)qMoOq, Сц$0 5Н О, йаНРО

Й2НгО, при следующем соотношении ингредиентов, (г/л воды):

30

40

ВНИИХИ Заказ 111э4/29 Тираж 525 Подцисиое .

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 1 массы 7-8 r на 10 л культуральной жидкости.

Пример. Культуру тионовых бактерий ТЬ1оЬасВЬа thiooxidans 58 Я выращивают в колбах на 2 л в жидкой среде следующего состава (среда Эмото): йат$зОэ« х5НгО 5 г; СаНР04 5 г; КНзРО4 3 г;

МИ4С! 0,5 г; MgCI> 6H O 0,1 г, вода водопроводная 1 л. Обьем среды в колбе

1,5 л. Время культивирования при постоянной аэрации при комнатной температуре

3 сут. Эта культура используется в качест ве материала для засева ферментера.

Пвименяют ферментер Ультроферм 1601 (ЛКБ, Швеция) на 5 л, снабженный системами поддерживания температуры и рН среды,, системой подачи среды, аэрации и перемешиваиия н электродом измерения концентрации кислорода. Фермеитер наполняют 3 л среды в дистиллированной воде, содержащей йазЗзОз.5йэО 10 г/л; КН2Р04 2 г/л;

Иаэйр04 ° 12Н О 1 г/л; МН4С! 0,5 г/л; раствор микроэлементов 1 мл/л. Такую же среду применяют и в проточном режиме.

Раствор микроэлементов содержит в 100 мл дистиллированной воды СаС4 4НтО 2 г;

НзВОз 30 мг; MgClq ° 6НзО 10 г, РеС1з

«6Н О 270 мг, ZnSO4 7Н О 72 мг; INaSQ4> 4НэО 55 мг; СоС1 10 мг, (НН4) э Мо04

25 мг; CuSO4 5НзО 0,15 мг.

Ферментер стерилиэуют при 110 С в течение 20 мин. В отдельной колбе стернлизуятт

1 М раствор карбоната калия, который служит ппрантом для поддерживания рН в ферменте ре.

Ферментер засевают через систему подачи среды 1 л посевного материала иэ 2-литровой колбы. Температура в ферментере— о

28 С. После засева азрацию н неремешиваиие цоддерживают .на минимальном уровне— концентрация кислорода до 60% от насыщения и скорость не 50 об/мин. °

Начало интенсивного роста бактерий (через сутки) характеризуется понижением рН. н кон центрацни кислорода и повышением оптической плотности при 540 нм.

При понижении РН культуры до 3,2 включают автоматическую систему подтнтровки нри помощи 1 М раствора карбоната калия, поддерживая величину рН постоянной, и по дачу свежей среды со скоростью 50 мл/ч.

067038 4

При понижении концентрации кислорода повышают интенсивность аэрации до 10 л/мии, повышая в то же время содержание СО в продуваемом воздухе до 6 — 8%. Скоросп церемешивания находится в пределах 100—

400 об/мин. При повышении оптической плотности культуры бактерий при 540 нм до 0,38 (оптическая плотность определяется методом отбора проб на спектрофотометре "Спектромом" (Венгрия) скорость потока среды постепенно увеличивают от 50 до 600 мл/ч. Интенсивный рост бактерий в проточньл условиях характеризуется постоянным расходом раствора карбоната калия для поддерживания рН культуры, концентрацией кислорода в пределах 10-20% от насыщения и оптической плотностио при 540 нм 0,38 — 0,42.

Клетки бактерий отделяют из культуральной жидкости центрифугированием на центрифуге К-70 (Янецки, ГДР) при 5000 об/мин.;

Выход сырой биомассы составляет 16 r иэ

20 л культуральной жидкости.

Использование изобретения обеспечивает повышение урожайности бактериальной культуры до 15 раз, а суммарная активность ферментов, превранщюших 0-рибозо-5-фосфат з присутствии АТФ в О-рнбулозо-1,5-дифоефат увеличивается до 20 раэ по сравнению с прототипом. Достигается хорошап воспроиэводимость при выращивании бактерий. Ферментер может работать непрерывно по меньшей мере

1 мес. Полученная за это время масса бактерий составляет 300 г. В соответствии с регламентом производства О-рибулоэо-1,5-днфосфата для получения 1 г О-рибулозо-1,5-дифосфата требуется ферментный нренарвт из 3,6 г сырой бактериальной массы. Обьем производства О-рибулозо-1,5-днфосфата составляет приблизительно 15 r в .год. Необходимая для этой цели бактериальная масса получается при использовании предлагаемого способа из 70 л культурапьной жидкости, а в случае периодического культивирования или выращи. вания бактерий по прототипу требуется 900 л культуральной жидкости. Соответственно уменьшается объем работы, связанный с изготовлением питательной среды и отделением

50 бактерий иэ культуральной жидкости при цеятрифугироваиии.