Питательная среда для определения лецитиназной активности синегнойной палочки

Питательная среда для определения лецитиназной активности синегнойной палочки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛВЦИГШ1АЗНОЙ АКТИЮЮСТИ СИНЕЩОЙНОЙ ПАЛОЧКИ, содержащая кальций хлористый, магний серноквслый, натрий хлористый, агар, диспшлированную воду, о тл н ч а ю щ а я с я тем, что, с целью ускорения и упрощения определения, она дополнительно содержит натрий двууглекисльп} и яичный желток при следующем соопюшении компонентов , г/л дастиллированной воды: Кальций хлористый0,05-0,15 Магний сернокислый 0/)5-d,I5 Натрий хлс сгьга4,75-5,15 Натрий двууглекислый0 ,05-0,15 § чикА желток20,0-30,0 ,0-20.0 (Л

ая <э

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

PECn_#_i JlHH

702 А

3(59 С 12 0.1/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

0,05-0,15 го,о-зо,о

12 0-20.0

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3357937/28-13 (22) 24.11.81 (46) 15.01.84. Бюл. N 2 (72) Т. С. Минина, А. Г.,Фестинатова и И. В. До. марадский (71) Всесоюзный научно-исследовательский ин-ститут прикладюй микробиологии (53) 576.093.31 (088.8) (56) 1. Справочник по микробиологическим и вирусалогическим методам исследования. од ред. М. О. Биргера. М., "Медицина", 1973, с. 252.

2. Ktinge Ч. К. Differenzierung der in wasser

vorkommenden Bakterien des genus Pseudomontis

olurch die Eigel breaktion. — Archive Hygienlund Вестегкйоду. 141, 1957, 348 — 360.

3. Оп P. Ч. Factory that iffuence toxiganicity of Pseudomonas aeruginosa. — 3. Bacteriology.

88, 1964, р. 1421 — 1427 (прототип). (54) (57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕЦИТ1 И:-1АЗНОЙ АКТИВНОСТИ

СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ, ций хлористый, магний сернокислый. натрий хлористый, агар, дистиллированную воду, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью ускорения и упрощения определения, она дополнительно содержит натрий двууглекислый н яичный желток лри следующем соотношении компонентов, г!л дистнплироваиной воды:

Кальций хлористый 0,05-0,15

Магний сернокислый 0,05-4,15

Натрий хлористый 4,75-5,15

Натрий диууглекислый

Яичный желток

1067042

Изобретение относится к микробиологии и может найти применение в клинических и научных (генетических) исследованиях.

Известна среда(Чистовича для определения лецитиназной активности кокков, содер- . 5

- жащая мясопептониый агар и яичный желток (3).

Известна питательная среда для определения лецитиназной активности псевдомонад, содержащая пептон NaqHPO4, КнэР04, яичный желток, MgSO4, глюкозу, агар и воду 12). 10

Однако известные среды не позволяют опре. делять лецитиназную активность синегнойной палочки. !

Известна также питательная среда для онределения лецитинаэной активности синегной- 15 ной палочки, содержащая кальций- хлористый, магний сернокислый, натрий хлористый, агар, дистиллированную воду, а также калий фосфорнокислый однозамещенный, глутаминовую кислоту и альфа-алании 13). 20

Однако данная среда не обеспечивает быстроты и простоты определения, так как фермента достаточно не накопляется и для его определения необходимо выполнить ряд дополнительных приемов: смыв вь|росших микроор- g5 ганизмов, центрифугирование, определений ак-. тивности лецитиназы путем титрования раствора, что требует дополнительного времени и труда.

Целью изобретения является ускорение и упрощение определения. . Эта цель достигается тем, что питательная среда для определения лецитиназной активности синегнойной папочки, содеужащая кальций хлористым,, магний сернокиспый, натрий xJI0» ристый, агар и дистиллированную воду, дополнительно содержит натрий двууглекислый и яичный желток при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной водьк

Кальций хлористый, 0,05-0,15

Mar urk еероокисль1й 0,05-0,15

Натрий хпористый 4,75-5,15

Натрий двууглекислый . 0,05 — 0,15

Яичный жспток 20,0-30,0

Агар 12 0 — 20,0

: Питательную. среду готовят следующим образом.

Готовят раздельно растворы солей, смешивают их с расплавленным агароми перед упот50 реблением в состав среды вводят желток в виде эмульсии. Введение змульсин желтка проводят в агаризованную среду, имеющую температуру не выше 50 С. Среду разливают в чашки и охлаждают. 55

B тех случаях, когда предполагается ойределение лецитиназной активности (например, нри генетических исследованиях) штаммов синегнойной палочки, требующих для своего развития определенных компонентов (аминокислот, витаминов и др.), компоненты также могут быть дополнительно введены в состав среды.

Пример 1. Готовят среду следующего состава, г/л:

Кальций хлорисгый

Магний сернокислый

Натрий двууглекислый

Натрий хлористый

Яичный желток

0,05

4,75

20,00 (удельный вес принимают за 1)

12.00

Агар-агар

Вода дистиллированная до 1 л.

Для приготовления cpejga предварительно от) вешивают на технических весах хлористый кальций, сернокислый магний, двууглекислый натрий, хнористый натрий и агар-агар в указанных количествах и растворяют их при постоянном помешивании, нагревая среду до расплав ления агара. Затем рН среды доводят до 7,4 и разливают ее по емкостям. Стерилизацию осуществляют автоклавированием при 121 С в течение 15 мин.

Приготовленные указанным способом чашки засевают штаммами РАО М1 4262 и

Ps.putida 8s 250, дпя чего на поверхность среды культуры . наносят петлей (штрихом) или пипеткой в виде капель в количестве

10 -5x10s клеток. Через 48 ч инкубации при оптимальной температуре (синегнойную палочку инкубируют при 37 С, à Ps. putida— нри 30 С)вокруг колоний синегнойной папочки появлялись ореолы, имеющие вид двухконтурного кольца: внутренний — матовый с металлическим блеском и внешний — прозрачный.

Бри работе с ауксотрофными штаммами до заполнения чашек Петри соответствующие . аминокислоты в виде стерильных растворов ,вносят в среду s количестве 0,02 г/л. Так, . для штамма FA0 М1 4262 синегнойной палочки в среду вносят гистидин, триптофан, метионин, иэолейцин и валин, а для штамма

SS 250 Ра; putida-триптофан. Затем к расплавленной и охлажденной до 50 С солевой основе, добавляют эмульсию яичного желтка (смесь равных обьемов желтка и физиологического раствора) в количестве 20 г/л, среду тщательно пепемешивают и разливают по чашкам Петри (15 — 20 мл). Чашки подсуцщ= ,. вают при 37 С в течение 40 мин. Чашки с эмульсией желтка готовят непосредственно перед опытом. расщепляли (т.е. не давали ореолов), образованы кишечной палочкой.

Пример 4. Готовят солевую среду с добавлением эмульсии желтка (без добавле ния аминокислот).

На среду высевают прототрофный штамм синегнойной палочки и штамм с А — 87 кишечной палочки, нуждающийся в дополнительных факторах питания.

Солевую среду с эмульсией желтка засевают с помощью пипетки (каплями) смесью отмытых ночных культур обеих видов бактерий. Через 48 ч на среде четко заметны коло нии синегнойной палочки, окруженные, двухконтурными зонами, свидетельствуюппеми о расщеплении лецитина. Кишечная палочка роста не дает (при посеве очень густых суспензий смешанных культур иногда появляются единичные колонии кишечном палочки; но ореолов вокругх них никогда не отмечалось).

П р и м е.р 5. Соленая среда с эмульсией желтка может быть использована также для выявления мутантов синегнойной палочки, лишенных лецитиназной активности.. В качестве объекта исследования используют штамм РАОм6 4262 и к среде добавляют ами нокислоты, соответствующие его питательным потребностям (cM. пример 1). Мутагенез осуществляют с помощью нитрозогуанида, Иэ

324 колоний штамма РАОм(. 4262 обнаруже; на одна колония без двухконтурного ореола.

Последующий рассев клеток этой колонии на солевой среда с эмульсией желтка и аминокислотами подтвердил, что это лецитиназо- негативный мутант.

Результаты определения лецигиназной активности исследуемых культур приведены в таблице.

Использование щпательной среды позволяет быстро и просто определять лецитинаэную активность синегнойной палочки, причем определение можно осуществлять визуально.

Питательная среда делает возможным определение лецитинаэной активности клинических штаммов синегнойной палочки с целью определения степени . их патогенности, изучение генетических особенностей этого. возбудителя, а также дифференциации ппаммов синегнойной, палочки от лецитиназоотрицательных псев-; домонад (например, Ps. put ida), встречающихся в одном и хопе же клиническом материале.

3 106704

Появление ореолов свидетельствует о нали-, чии лецитиназной активности у исследуемой культуры. В чашках с культурой Ps. putida ореола вокруг колоний не наблюдается, из чего можно сделать вывод об отсутствии лецитинаэной активности у исследуемого организMR.

Четкое различие в морфологии колоний, регистрируемое визуально, позвоЛяет дифферен цировать синегнойиую палочку от некоторых 10 непатогенных псевдомонад.

Пример 2. Готовят среду следующего состава, г/л:

Кальций хлористый 0,15

Магний сернокислый 0,15 t5

Натрий двууглекислый 0,15

Натрий хлористый 0,15

Яичный желток 30,00

Агар-агар 20,00

Вода дистиллированная до 1 л 20 рН среды 7,2

Технические приемы для приготовления чашек Петри со средой такие же, как и в примере 1. Однако до добавления эмульсии желтка к одной порции среды добавляют аминокислоты, соответствующие питательным потреб. ностям штамма Я,А-87 (аргинин, гистидин, лейцин, пролин), и витамин Ât. Ко второй порции среды аминокислоты и витамин В1 не. прибавляют, поскольку она предназначена для

„. 30 выращивания прототрофного штамма синегнойной палочки. Рост кишечной палочки на среде с добавками аминокислот и сннегнойной палочки на среде, содержащей лишь эмульсию желтка, отмечался уже через 2 сут после посева ! ,2х10 клеток (инкубация в обоих случаях проводилась при температуре 37 С), по образование. двухконтурных ореолов вокруг коло,ний отмечалось только на среде, инокулироt ванной сииегнойной палочкой.

П р и и е р 3. На среду с аминокисло;тами и витамином В, (согласно примеру 2) сеют одновременно культуры кишечной и си,негнойной палочек (смесь содержала примерно по 100 клеток каждого вида бактерий).

Через 48 ч выращивания при 37 С отбирают по 10 колоний с двухконтурным ореолом и без него, Общепринятый анализ культураль. о ио-биохимических свойств показал, что все колонии с ореолами принадлежали синегнойной палочке, а колонии, которые лецитин не

1067042

Способ посева материала

201

P. put lds

BS-250

120

P. аегид1поаа 1822

230

8к

36к

133

120

42 к

2732 ф

185

Е. co1i Ga-87

188

Мутанты Р. авгиев 1поаа

4262 П вЂ” 16 (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) Составитель Г. Смирнова

Техред Т.Маточка Корректор О. Тигор

Редактор Т. Веселова

Заказ 11154/29 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

П р и м е ч а и и е: Цифры в таблице означают число выросших колоний на чашке;

"+"- наличие лецитиназной активности; "—" — отсутствие лецнтиназной активности.