Способ индикации нитевидного вируса пчел

Способ индикации нитевидного вируса пчел

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ИНДИКАЦИИ НИТЕВИЦНО-ГО ВИРУСА ПЧЕЛ, включёиоадий постановку реакции двойной иммунодиффузйи в агаре испытуемого антигена с иммунной сывороткой, о-т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повышения эффективности способа, в качестве иммунной сыворотки исполь:зуют кроличью гипериммунную сыво ,ротку, полученную с помощью штамма Apis filamentous virus 31.

ССЮЭ СОВЕТСНИХ ВНЦ

РЕСПУЬЛ4Н

3(5Р С 12 N 7/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ )

К АВТОР(;КОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ф

1за зйй1Ь А

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3445496/30-15 (22). 07.04.82 . (46) 23.01.84. Бюл. Ф 3 (72) Ю.М.Батуев, О.Ф.Гробов, Г.А.Надточей и М.Л.Обухов (71) Всесоюзный ордена Ленина научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (53) 576.858(088 ° 8)

-(56) 1. ВаЛ.Реу L., Carpenter. G.Ì. и Woods R.D ° Properties of"à bitamentous virus of the honey bee.

Virology", 1981, v. ll4, Р 1, р.1-2 .(прототип).

„„SU„„1068475 A (54) (57) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ НИТЕВИДНО-ГО ВИРУСА ПЧЕЛ, включающий постановку реакции двойной иммунодиффузии в агаре испытуемого антигена с иммунной сывороткой, о.т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения эффективности способа, в качестве иммунной сыворотки используют кроличью гипериммунную сыво.ротку, полученную с помощью штамма

Apis filamentous virus 9 31.

1068475

55

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к разработке способа индикации нитевидного вируса пчел (НВП) °

НВП вызывает заболевание медоносных пчел, сопровождающееся потерей способности к полету, параличом конечностей, наличием гемолимфы молочно-белого цвета, разрушением клеток гемолимфы в пчелиной семье наблюдают постоянную небольшую ги- 10 бель пчел, либо семья погибает. В совреМенных условиях развития крупных пчеловодческих и матковыводных совхозов НВП может нанести большой экономический ущерб народному хоэяйст- J5 ву

Морфологические признаки. Частицы НВП эллипсоидной формы, размером

400 100 нм или 450-150 нм, состоят иэ нуклеокапсида, размером 3000 60 или ЗООО 40 нм, заключенного в оболочку.

Физико-химические свойства. Нуклеокапсид содержит двухнитевую

ДНК с молекулярным весом приблизительно 12 10 6 дальтонов, плавучие плотности в хлористом цезии целой частицы, нуклеокапсида и ДНК вЂ” равны соответственно 1,28; 1,36 и 1,71 г/см", Частице НВП содержит примерно 12 белков с молекулярными весами от

13 до 70 кД, которые приблизительнс равномерно распределены между обо-. лочкой и нуклеокапсидом.

Биологические свойства. НВП поражает только медоносных пчел; ра- З5 бочих особей и маток. Он обнаружен в следующих органах пораженных особей: мозге, вентральном нервном тяже, глоточных, верхнечелюстных и восковых железах, жировом теле, большой ядовитой железе и резервуаре этой железы, средней кишке, яични". ках и гемолимфе. Репродукция вируса отмечена лишь в жировом теле и яичниках. В инфицированных, клетках 45 жирового тела и яичниках отмечено разрушение ядерных оболочек. Экспериментальная инфекция была вызвана у взрослых рабочих пчел при скармливании или иньекции выруссодержащих препаратов. Не удалось заражение пчелиных личинок 1-ro возраста, мышат-сосунов, 21-дневных мышей, тараканов и личинок большой восковой моли. НВП широко распространен в

США, Англии, обнаружен в Японии, Новой Зеландии и Италии.

НВП был обнаружен с помощью электронно-микроскопического исследования экстрактов из мертвых пчел или геьюуимбы из живых пчел 11). .60

Недостатком известного способа индикации является то, что электронный микроскоп является уникальной дорогостоящей аппаратурой и не доступен практическим лабораториям.

Цель изобретения - повышение эффективности способа индикации нитевидного вируса пчел.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу индикации нитевидного вируса пчел, включающему постановку реакции двойной иммунодиффузии в агаре испытуемого антигена с иммунной сывороткой, в качестве иммунной сыворотки используют кроличью гипериммунную сыворотку, полученную с помощью штамма

Apis fiFamentaus Virus В 31.

Для получения кроличьей гипериммунной сыворотки в качестве антигена используют вирионы НВП штамма

9 31. Пчел в количестве 100-150 штук, зараженных данным штаммом и погибших от НВП, механически гомогенизируют общепринятым методом с добавлением 0,01-0,03 М фосфатного буфера рН 7,0-7,2 (1 мл на пчелу).

Гомогенат осветляют при 1800-2000 g

8-10 мин, супернатант центрифугируют при 8000-10000 g 20-25 мин.

Осадок суспендируют в 2-3 мл 0 010,03 М фосфатного буфера рН 7,0-7,2 и концентрированную вируссодержащую суспенэню центрифугируют в градиенте плотности сахарозы от 20 до 60% в течение 3-3,5 ч при 3000032000 g. Собирают фракцию, содержащую вирус, при помощи подходящего шприца с иглой, доводят ее до объема 3-4,5 мл физиологическим раствором, делят на три,равные части, разливают во Флаконы и замораживают.

Гипериммунизация кроликов, Перед первой инъекцией одну часть полученного антигена раэмораживают, смешивают с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 и вводят кролику в подушечки задних лапок по 0,2-.

0,3 мл, в бедренные маисы по 0,50,75 мл и внутрикожно в три точки спины по 0,2-0,3 мл. Вторую инъекцию делают через 21 день, при этом одну часть аитигена размораживают, доводят Физиологическим раствором до объема 2-3 мл и вводят кролику внутривенно. Третью инъекцию делают внутривенно аналогичным образом через 7 дней после второй. Обескровливание кроликов проводят на

7-10 день после третьей инъекции, кровь собирают в стерильную колбу, выдерживают при 37ОС до образования сгустка, отделяют от стенок стерильной стеклянной палочкой и оставляют при 4 С на ночь. На следующий день сыворотку отсасывают, консервируют мертиолятом в соотношении

1:5000-1:10000 и запаивают в ампулы.

Исследуемых пчел в количестве

8-12 штук гомогениэируют механически с добавлением 8-12 мл дистиллированной воды. Гомогенат оставляют

1068475

Составитель С. Светлышев

Редактор Г.Волкова Техред И.Метелева Корректор Л.Патай

Заказ 11397/22 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035р Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 при 1000-, 2000 g в течение 8-10 мин, супернатант центрифугируют при

8000-10000 g в течение 20-25 мин. . Образовавшийся осадок суспендируют в 0,1-0,2 мл дистиллированной воды и используют в качестве .нтигена. 5

Одновременно аналогичным образом готовят контрольный положительный антиген из пчел, погибших от НВП штамма 9 31. Используют агар Дифко . В качестве растворителя для приготовления 0,9-1%-ного раствора геля применяют 0 1-0,2 М боратный буфер (рН 8,4-8,5) с добавлением 5-8 г хлористого натрия на 1.л раствора. Реакцию ставят в чашках Петри или на предметном стекле. Учет реакции проводят по формированию полос прецинитации.

Данный способ может быть представлен в двух вариантах: макрометодом по Ouchter3oni (1948) и микрометодом no Nansi (1958). .Макрометод. В чашке Петри или на предметном стекле получают слой агарового геля толщиной 1,5-2 ми, вырезают лунки диаметром 5-7 мм (расстояние между лунками 3-6 мм).

Лунки заполняют антисывороткой и антигенами до краев, инкубируют во влажной камере при комнатной температуре. Учет реакции проводят 30 через 24-36 ч по Формированию полос преципитации.

Микрометод. В чашке Петри или на предметном стекле получают слой агарового геля толщиной 0,8-1,5 мк 35 (расстояние между лунками 1,41,6 мм) ° Лунки заполняют антисывороткой и антигенами до краев, инкубируют во влажной камере при 3537 С. Учет реакции проводят через 40

3=6 ч по формированию полос преципитации. Использование микрометода реакции двойной иммунодиффузии снижает расход реагентов, сокращает время получения результатов реакции.

Приготовление антигена для реакции. Восемь исследуемых пчел гомогенизируют механически с добавлением 8 мл дистиллированной воды.

Гомогенат осветляют при 1000 g в течение 8 мин, супернатант центрифугируют при 8000 g 20 мин ° Образовавшийся осадок суспендируют в 0,1 мл дистиллированной воды и используют в качестве антигена. В макро- или микрометоде реакции двойкой иммунодиффуэии с гомологичной .антисывороткой полученный антиген образует 1-2 полосы преципитации °

10 исследуемых пчел гомогениэируют механически с добавлением

10 мп дистиллированной воды. Гомогенат осветпяют при 1500 g в течение 9 мин, супернатант центрифугируют при 9000 g в течение

22,5 мин. Образовавшийся осадок суспендируют в 0,15 мл дистиллированной воды и используют в качест-. ве антигена. В макро- или микрометоде реакции двойной иммунодиффуэин с гомологичной антисывороткой полученный антиген образует

I-2 полосы преципитации.

12 исследуемых пчел гомогенизи-. руют механически с добавлением

12 мл дистиллированной воды. Гомогенат осэетляют при 2000 g в течение 10 .мин, супернатант центриФугируют при 10000 g в течение

25 мин. Образовавшийся осадок суспендируют в 0,2 мп дистиллированной воды и используют в качестве антигена. В макро- или микрометоде реакции двойной иммунодифФузии с гомологичной антисывороткой полученный антиген образует

1-2 полосы преципитации.

Предложенный способ апробирован нами с положительным результатом в лабораторных условиях.

Предложенный способ является простым, доступным и достоверным.

Применейие его в ветеринарной практике позволит своевременно выявлять данный вирус. Способ найдет применение s научно-исследовательских институтах, областях и районных ветбаклабораториях.