Способ получения комплекса ферментов

Способ получения комплекса ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГО ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Д211 3422521/28-13 (221. 17. 02. 82 (46) 23.01.84. Бюл. Р 3 (72) Н.И.Даниляк, В.Д.Сеьичаевский,, Г.Г.Мельничук, В.В.Яковенко, И.A.Трутнева и Л.Г.Дудченко (711 Институт ботаники им.. Н.Г.Холодного AH Украинской CCP . (53) 577-15(088 ° 8) (56) 1. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М., "Пищевая промышленность", 1975.

2. Афанасьева М..М. и КадыРов P.N.

"Микрологияи фитопатология". 1980., т. 14, в 5, с. 410-418 (прототип ). (541 t 57 ) 1. СПОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСЛ . ФЕРМЕНТОВ путем культивирования . высших базидиальных грибов на питательной среде, содержащей источник . углерода, минералЬные соли: однозамещенный. Фосфат аммония, однозамещенный фосфат калия, двузамещенный фосфат калия, сульват магния, и воду с последующим отделением. Фильтрата культуральной жидкости от мицелия и остатков твердого субстрата, отличающийся тем, что, с целью расширения ассортимента ферментрв в комплексе, повышения выхода целлюлоз, пектиназ, пероксидазы, монофенолмонооксигеназы и снижения

„„SU„„1068477 А

36 9 C 12 N 9/00; С 12 Б 1/20 себестоимости получаемого продукта, применяют комплексную среду, в которой используют в качестве источников углерода целлюлозу в виде отходов фильтровальной бумаги или солоьы, экстракт из свекловичного жома и гидрол, а также дополнительно вносят тиамин при следующем соотношении компонентов, мас.В:

Целлюлоза 1,30-1,50

Экстракт.из свекловичного жома 8,80-9,00

Гидрол - 0,40-0,50

Э Тиамин 0,00015-0,00020

Одноэамещенный фосфат аммония О, 17-0, 20

Одноэамещенный е Фосфат калия 0,05-0,06

Двуэамещенный фосфат калия 0,03-0,04 в

Магний сернокислый 0,04-0,05 Ъ

Вода водопроводная До 100 0

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся, тем, что после отделения культуральной жидкости от твердой (, Фазы проводят дополнительную экстракцию ферментов, иммобилизованных на твердых компонентах питательной QQ среды 0,5 н. ацетатным буфером при р рН 4,0 в течение часа при 10 С. 3

1068477

20

Изобретение относится к ферментной отраоли микробиологической про ьвииленности, а именно к способам получения ферментов, и может быть . ,использовано в производстве ферментов, и может быть использовано в производстве ферментов и других биологически активных веществ, .применяемых в винодельческой, кон сервной, фармацевтической, химической промышленности, а также в сель° ском хозяйстве.

Известны способы получения ферментов, в частности целлюлоз, пектиназ, монофенолмонооксигеназ и пероксидаэы, которые предусматривают. культивирование их продуцентов, например плесневых грибов, дрожжей, высших баэидиальных грибов и др. на питательной среде, содержащей воду, минеральные соли и органические добавки с,последукщим отделением культуральной жидкости от мицелия и остатков твердого субстрата.

Органические добавки. могут включать источники углерода, источники азота, соединения, стимулирукщие,биосинтез отдельных ферментов, например солому, опилки, хлопок, фильтровальную бумагу, мякоть свеклы, свекловичный жом, экстракты из свекловичного 30 жома, виноградных выжимок, солодо-. вых ростков. н др. $1).

НЕдостатком известных способов является то, что они позволякт интенсифицировать биосинтез отдельных .35 ферментов, однако для эффективного гидролиза сложных субстратов, например, в пищевой промышленности, при переработке отходов лесной, деревообрабатывакщей промышленности, 40 сельского хозяйства и. др. требуется . применение ферментных комплексов, включающих одновременно высокоактивные целлюлозы, пектинаэы, монофенолмонооксигеназы и пероксидазу ° 45

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является, способ получения комплекса ферментов путем культивирования высших баэидиальных грибов на питательной среде, содержащей источник углерода, минеральные соли: одноэамещенный фосфат калия, двузамещенный фосфат калия, однозамещенный

;фосфат аммония, сульфат магния, и воду, 55 с последующИм отделением филь трата культуральной жидкости от мицелия и остатков твердого субстрата, согласно которому, наряду с высшим базидиальным грибом, культивирует низший 60 гриб, например Pleurotus astreatus и . Риваг urn cukmorum (2 .

Недостатками известного способа являются высокая стоимость и технологическая сложность выращивания 65 одновременно двух культур, отсюда— большой расход посевного материала, а также недостаточно широкий ассар-. тимент ферментов. . Целью изобретения является расширение. ассортимента ферментов в комплексе, повышение выхода целлюлоз, пектинаэ, пероксидазы, монофенолмюнооксигеназы и снижения себестоимости получаемого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согЛасно .способу получения комплекса Ферментов путем культиви рования высших баэидиальных грибов на питательной .среде, содержащей .источник углерода, минеральные соли: одназамещенный фосфат аммония, однозамещенный фосфат калия, двузамещенный фосфат калия, сульфат магния, и воду с последующим отделением1фильтрата культуральной жидкости от мицелия и остатков твердого субстрата, применяют кбмплексную среду, в которой используют в качестве источников углерода целлюлозу в виде отходов фильтровальной бумаги или соломы, экстракт свекличного

Ф жома и гидрол, а также дополнительно вносят тиамин при следующем. соотношении компонентов, мас.Ъ:

Целлюлоза . . 1,3-1,5

Экстракт из свекловичного жома 8 8-9,0

Гидрол 0,4-0,5 Тиамин 0,00015-0,00020

Однозамещенный фосфат аммония . 0,17-0,20

Однозамещенный

Фосфат калия 0,05-0,06

Двузамещенный фосфат калия 0,03-0,04

Магний сернокислый 0,04-0,05

Вода водопроводная До 100

После отделения культуральной жидкости от твердой фазы проводят дополнительную экстракцию ферментов, иммобилиэованных на твердых компонентах питательной среди 0,5 н.ацетатным буфером при рН 4,0 в течение часа при 10 С.

Пример 1. Использовали

Coriolus hirsutus 069, который выращивали при 26-28 С методом поверхностной пленки на комплексной питательной среде следующего состава, мас.Ъ:

Среда 1

Фильтровальная бумага 1,31

Экстракт иэ свекловичного жома 8,80

Гидрол . О, 43

Тиамин 0,00015

NHgHgP0 0,17

0,052

0,035

М 8О4 0,043

Вода водопроводная . До 100

1068477

40 культура.. С с ь гидролизу целлюлозы

Экзо-1, 4-/3-(глюканаэа ) ная бумага, мгЪ глюкозы

133,5 0

Карбоксиме,тилцеллюлоза, мгЪ глюкозы

0 34,5

0 0 4,5 0

81,5 0

В качестве контроля использовали также питательные среды, которые включают компоненты, стимулирующие биосинтез отдельных ферментов— целлюлоза (среда 2ф, пектиназ (среда 3), монофенолмоноокситеназ 5 (среда 4 ) мас. Ъ:

Среда 2

Фнльтровальная бумага 1,47

Тиамин 0,00015 и Н4 Н РО4 0,19

КнрРО», . 0,059

К, Н Р Хф 0,039

igso< 0,049

Вода водопроводная До 100

Среда 3 15

Экстракт иэ свекловичного жома 9,0

Тиамин 0,00015 рН„Н PО+ 0,18

КН2Р04 О, 054 20

К2 4 0,036

М88О4 0,045

Вода водопроводная До 100

Среда 4

Гидрол 0,49 25

Тиамин . . 0,00015

НН НРО4 0,20

КН„.РО+ 0,059

K2hPO4 . 0,039

И88О 0,049 30

Вода водопроводная До 100, В процессе культивирования Coriolus hirsutus на третьи, шестые и десятые сутки определяли способность к гидролизу нерастворимой целлюлозы, а также активности эндо-1,4-У-глюканазы, экэо-1,4-р-глюканазы, полйгалактуроназы экэополигалактуроиазы, пектинэкстеразы, монофенолмоноокси генаэы (полифенолоксидаза, лаккаэа) и пероксмдаэы в фильтратах культу- . ральной жидкости, получаемых путем отделения мицелия и остатков твердого субстрата. Результаты измерений представлены в табл. 1, из которой следует, что использование 45 комплексной среды, содержащей одновременно соединения, стимулирукицие биосинтез указанных ферментов, позволяет с 1,5т4,0 раза интенсифицировать процесс и расширить ассор- 50 тимент ферментов комплекса.

Экстрагирование 0,5 н.ацетатным буфером рн 4,0 иэ остатков твердого субстрата в течение 1 ч при110 С позволило дополнительно увеличить выход эндо-1,4-р-глюканаэы, экэо1,4-Р-глюканаэы, полнгалактуроназы,. экзополигалактуроназы и пектинэсктеразы .(табл. 2).

Пример 2. В качестве продуцента использовали Соriolus versicolor (Fr). Ruel, nei 087, Состав .среды 1, мас.Ъ

Филътровальная бумага 1,40

Экстракт иэ свекловичного жома 9,00

Гидрол 0,50

Тиамнн 0,00015

ВН НУРО4 0,20

КН2 РО4. 0,06

К НР 0,.045

Вода До 100

Полученные результаты представлены в табл. 3(уровни активностей внеклеточных ферментов при выращивании на комплексных средах с целлюлозой в виде отходов фильтровальной бумаги (1) нли соломы (2).

B контроле — среды, где в качестве единственного источника углерода испольэовали отходы фильтровальной бумаги (3), солому (4), экстракт из свекловичного жома (5) илн гидрол (6), .(5-суточная культура). . Пример 3. Состав сред и условия культивирования аналогичны примеру 1. Продуцент Pleurotus astr6atus (Fr) Kumm шт. К-69, Время культивирования 10 сут.

В табл. 4 представлена актив- ность Pleurotus astreatus К-69 на различных средах.

Пример 4. Состав сред аналогично примеру 1. Продуцент

Irpex lacteus Fr. 0187.

Полученные результаты представлены в табл. 5.

Изобретение позволяет снизить себестоимость готового продукта примерно на 30%.

Таким образом, реализация изобретения обеспечивает расширение ассортимента ферментов в комплексе, повышение выхода целлюзол, пектиназ, пероксидаэы, монофенолмонооксигенаэы, и снизить себестоимость получаемого, продукта.

Т а блица 1

0 0 56,7 56,7 25,2 83,7

1068477

Продолжение табл.1

3-суточная культура б-суточная культура

Фермент

Субстрат

1 3 4

«ФВМ ВВ ВЮ Ф ° W »«

10,6 4,6 6,8 2,6 13,4 7,7 6,8 4,9

Полигалакту-. ронаэа

31,2 21,1 37 0 33,3 250,0 100,0 142,8 111,1

Экэополигалактуроназа

5 б 1 7 3 7 3 О 1 5 1 О 1 5 2 6

0,1 0,2 0,1 0,3 0,1 . 0,2 0,1 0

Монофенолмонооксигенаэа

Еензидин, ед/мл

Конофенолмонооксигеназа

Пирокатехин, ед/мл

Пероксидаза

Бензидин, ед/мл

1,4 О .ф 0 0 5,4 0,6 0,9 5,6

Продолжение табл. 1

10-суточная культура

Фермент

Варианты йитательной среды (2 ) 3

Способность к гидролиэу целлюлозы

50,7

Экэо-1, 4-8глюканаза

59,0

10?,0

Эндо-1, 4-/3глюк аназ а

37,0

2,7

5,7

4,0

Полигалактуроназа

125, О

200 0

208,3

500,0

Экзополигалактуронаэа

3,4

4,1

6,2

7,2

Эндо-1,4+глюканаза

Ф

Пектинэкстераза

Карбоксиме. тилцеллюлоза, Ъ деполимеризации

Пектин свекловичный, ед/мл

Пектовая кислота, ед/мл

Высокометоксилированный пектин, ед/мл

1,7 О

0,6 0

Варианты питательной среды

2 3 4 1 2

0 0 6,1 0 0,7 6,0

О 0 1,0 0 0 0,6

1068477

10-суточная культура

Фермент.т

Варианты питательной среды

2 ) Пектинэкстераза с

0,1

0,1

0,2

Монофенолмонооксигеназа

4,2

11,2

Монофенолмонооксигеназа.

0,6

1,3

0,6

0,6, Пероксидаэа

3 7

0i3

Примечание.

Таблица 2

10 суточная культура

Ь-суточная культура

3-суточная культура

Субстрат

Фермент

0,6 .0

0,5

Экзо-1,4-ф- . Карбоксиметилглюканаза целлюлоза, мг.% глюкозы

4,0 46,1 4,2 40,2 7,0

38,1

Эндо-1, 4-рглюканаза

Полигалактуронаэа

16,6 20,8 18,2 25,4 .0

16,6

Экзополигалактуронаэа

Пектовая кислота, ед/мл

1,2

0,9 1,5 0,5 1;0

0,9

Пектннэкстераза

0

П р и м е ч а н и е. 1 — комплексная питательная среда согласно изобретению; - среда с фильтровальной бумагой.

Способность к гидролизу целлюлозы

Фильтровальная бумага, мг.% глюкозы

Карбоксиметилцеллюлоза, % деполимери-зацииПектин свекловичный, ед/мл

Высокометокси-. лированный пектин, ед/мл

I . Продолжение табл. 1 (I - комплексная питательная среда согласно изобретению у 0 - среда с фильтровальной бумагой; Й - среда с экстрактом из стекловичного жома lV - среда с гидролом.

Варианты питательной среды и I

10,0 10,0 8,0 11,4 14,0 14,0

1068477

Таблица 3

Фермент

Субстрат

1 2

Экэо-1,4- 3глюканаза

50,0 84,8 50,0 12,4 30,5 14,0

Эндо-1,4-./5глюканаза

80,7

33,8 41,4

63,8 43,4

6,6

4,0

51,5 22,5

48,0 9,0

Полигалактуронаэа

12 5 93 3 75 7

58,1 26,3

Экэополигалактуронаэа

0,6

0,4

0,20 0,6

2,3

Пектинэкстераза

0,13.0 0,46

0,16

Бейзидин, ед/мл

Следы 9,2 6,6 5,6

Пероксидаза. 5,8. 13 Ь

Бензидин, ед/мл

6 4 5,3

12,0

7,8

5,6

Т а б л и ц а 4

Комплексная среда

Среда с гидролом

Субстрат

Фермент

Экзо-1, 4-Pглюканаза

280,3 0,4

Эндо-1, 4-рглюканаза

18,5

4,9

27,0

Полигалактуроназа

5 О, 3

625,0

0,10

0,34

Способность. к гидролизу нерастворимой целлюлозы

МоноФенолмонооксигеназа

3R 3OITGJIHгалактуронаэа

Карбоксиметилцеллюлоза, мг %

Карбоксиметилцеллюлоза, усп. %

Фильтровальная бумага, мг %.

Пектин свекловичный, ед/мл

Пектовая кислота, ед/мл

Высокометоксилированный пектин, ед/мл

Карбоксиметилцеллюлоэа, мг%

Карбоксиметилцеллюлоэа, % деполимеризации

Пектин свекловичный, ед/мл

Пектовая кислота, ед/мл

Комплексные среды

) з

Среда с целлюлозой

Контрольные среды

I 1

Среда с экстрактом из жома

1068477

Продолжение табл.4

Пектинэкс тераза

Следы

Бензидин, ед/мл

Пероксид аз а

0,27

Бензидин, ед/мп

18,0

0,9

25,4

Следы

Т а б л и ц а 5

Комплексная среда

Среда с гидролом

Среда с ./

Субстрат

Фермент

Эк з о-1, 4 «Яглюканаэа

35,5

322, 3

Эндо-1, 4 .@глюканаза.

87, 7

51,1

48,7.250,0

0,92

2,64 Пероксидаза

Бензидин, ед/мл

2,1

0,6

Следы

9,2

Бензидин, ед/мл

1,7

7,8

Следы. Составитель Е. Воробьева

Редактор Г. Волкова ТехрЕд C,Èèãóíîsà Корректор А. Тяско!

Заказ 11805 Тирам 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 монофенолмонооксиге наза

Эндополигалактуроназ а.

Экзополигалактуроназа

Монофенол.монооксиганаза

Высокометоксилированный пектин, ед/мп 0,27

Карбоксиметилцеллюлоэа, мг В

Карбоксиметилцеллюлоэа, Ъ деполимериэации

Пектин свекловичный, ед/мл

Пектовая кислота, ед/мл

Среда с целлюлозой экстрактом из. жома