Способ получения низших @ - @ -аминокислот

Способ получения низших @ - @ -аминокислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗШИХ 0 -L-АМИНОКИСЛОТ ИЗ соответствующих низших ot-кетркислот в присутствии специфической по отнсшению к субстрату дёгидрогеназы, соли аммония и никотинамидадёйиндинуклеотида (НАДVHAflH) при одн9времённой регенерации НАДН из НАД отличаю-, щ и и с я тем, что, с целью упроадения процесса, в реактор с мембраной для ультрафильтрации, средний размер пор кот.орой равен 1-3 мкм, помещают раствор форьшатдегидрогеназы и специ .фической по отношению к исходной низшей oi. -кетокислоте дегидрогеназы , содержащий НАД VHAДH в концентрации 3,55-3,92 1 1моль/л, который связан с полизтиленгликолем со средним молекулярным весом 10 000, непрерывно подают водный раствор, содержащий 100-500 ммоль/л исходной сА--кетЬкислоты в виде водорастворимой соли и водный раствор формиата аммония в качестве соли аммония концент- § рацией 400-800 ммоль/л, причем разность давления по обе стороны мембра- /Л на поддерживают 0,2-0,5 бар, и непре-V рывно отводят из реактора через мемб- 1. рану поток фильтрата, содержащий целевой продукт 2

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 2954169/23-04 (22) 24.07.80 (31) Р 2930070.7 (32) 25.07.79 (33) ФРт (46) 23.01.84. Бюл. 9 3 (72) Кристиан Вандрей, Рольф Вихманн, Вольфганг Лойхтенбергер, Мария-Регина Кула и Андреас Бюкманн (ФРГ) (71) Дегусса АГ (ФРГ) и Гезельшафт фюр биотехнологише форшунг мбХ (ГБФ) (ФРГ) (53) 547.466.07 (088.8) (56) 1. Патент Франции 9 2217296, кл. С 07 В 29/00, опублик. 1974 (прототип) . (54)(57) СПОСОБ НОЛУЧЕНИЯ НИЗШИХ . о(-(=АМИНОКИСЛОТ из соответствующих низших о(.-кетокислот в присутствии специфической по отношению к субстрату дегидрогеназы,. соли аммония и никотинамидадениндинуклеотида (НАД+/НАДИ) при одновременной pere,.SU„„> 069622 A

3(Я) С 07 С 101/04//С 07 В 29/00:

С 12 Р 13/0 4 нерации НАДН из НАД о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения процесса, в реактор с мембраной для ультрафильтрации, средний размер пор которой равен 1-3 мкм, помещают раствор формиагдегидрогеназы и специ. фической по отношению к исходной низшей о -кетокислоте дегидрогеназы, содержащий НАД+/НАДН в концентрации 3,55-3,92 ммоль/л, который связан с полиэтиленгликолем со средним молекулярным весом 10 000, непрерывно подают водный раствор, содержащий 100-500 ммоль/л исходной а ;кетокислоты в виде водорастворимой соли и водный раствор формиата аммония в качестве соли аммония концент" Е рацией 400-800 ммоль/л, причем разность давления по обе стороны мембраны падцерживают 0,2-0,5 бар, и непрерывно отводят из реактора через мемб..С„ рану поток фильтрата, содержащий целевой продукт.

1069622

Изобретение относится к yCosepшествованию1 получения низших cL- аминокислот, использующихся в фармакологии, пищевой промышленности, а также в качестве исходных соединений в пептидном синтезе.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения низших

0 -L-аминокислот, "-аключающийся в том, что исходную соответствующую с4 -кето, кислоту вводят во взаимодействие со . специфической к субстрату дегидрогеназной в присутствии 0,1 М водного раствора соли аммония (например, двузамещенного Фосфата аммония), никотинамидадени динуклеотида (НАД+/НАДН) 15 при одновременной регенерации ,,НАДН из НАД + с помощью метанола, этанола или этоксйэтанола в присутствии алкогольдегидрогеназы. При этом концентрация никотинамидаденин- 20 динуклеотида составляет приблизитель" но 1 ммоль/л, концентрация исходной ,d.-кетокислоты 10 ммоль/л, выходы целевых продуктов 4,4-93,1Ъ (без учета . стадии их отделения от никотинамида- 25 дениндинуклеотида, ферментов и фосфата аммония) (1).

Недостатком известного способа является сложность проведения процесса, связанная с необходимостью отде- З() ления целевых продуктов от никотинамидадениндинуклеотида, дегидрогена-, зы кетокислоты и алкогольдегидрогеназы. В результате этого указанные

Ферменты инактивируются, а никотинамидадениндинуклеотид может частично разрушаться, что делает практически невозможным повторное использование укаэанных компонентов.

Целью изобретения является упроще- ние процесса знзиматического получе- 40 ния низших 0 - -аминокислот из соот- ветствующих низших о(.-кетокислот.

Указанная цель достигается способом получения низших е(-L-аминокислот иэ соответствующих низших

c(-кетокислот, заключающимся в том, что в реактор с мембраной для ультрафильтрации, средний размер пор кото-

Рой Равен 1-3 мкм помещают Раствор 5() формиатдегидрогенаэы и специфической по отношению к исходной низшей о(-кетокислоте дегидрогеназы, содержащий

НАД+/НАДН в концентрации 3,553,92 ммоль/л, который связан с полиэтиленгликолем. со средним мол-.весом

10 .000, непрерывно подают водный раствор, содержащий 100-500 ммоль/л исходной с(- кетокислоты в виде водорастворимой соли, и водный раствор . формиата аммония в качестве соли ам- 60 мония концентрацией 400-800 ммоль/л, причем разность давления по обе стороны мембраны подцерживают в пределах 0,2-0,5 бар,, и непрерывно отводят иэ реактора червэ мембрану поток 65

Фильтрата, содержащий целевой .продукт. Как правило, соотношение между активностями формиатдегидрогеназы и специфической по отношению к субстрату дегидрогеназы находится в интервале 1с(1-5) .

Как йравило, имаобилизацию никотинамиддинуклеотида на полиэтилен-, гликсле проводят обработкой кофермен. та этиленимином с последующей концентрацией полученного М -аминоэтильного производного с карбоксилироваи-, .ным полиэтиленгликояем с помощью водорастворимого карбодиимида, после чего иммобилизованнЫй продукт восс- . танавливают до соответствующего про-. изводного." - НАДН, превращают, перегруппировкой по Димроту в N-производное и, в случае необходимости, окисляют до соответствующего производного НАД+.. При этом концентрация коэнзима обычно составляет 0,1—

10 ммоль/л, предпочтительно 1

7 ммоль/л.

Концентрация формиата аммония предпочтительно должна быть равной концентрации исходной -кетокислоты или, по крайней мере, не ниже последней.

Величину рН реакционной смЕси прн. проведении процесса обычно поддерживают в интервале 5-9.

Как правило, целевые продукты выделяют известными способами, например, с помощью анионообменнйх смол.

Осуществление предлагаемого способа дает упрощение процесса получения низших д.-(;-аминокислот из соответствующих низших o(,-xexoiac o и заключается в более простом отделении целевых продуктов от исходных, например с помощью анионобменных смол; в воэможности неоднократного повторного использования дорогостоящих компонентов - формиатдегидрогеназы., специфической по отношению к исходной о -кетокислоте дегидрогеназы, никотинамидадениндинуклеотидаf в непрерывности проведения процесса; в меньшем объеме. реакционной смеси (за счет увеличения концентраций) .

Пример 1. Термостатируемый при 40 С реактор объемом 10 мл с плоской мембранной, снабженный магнит ной мешалкой и мембраной для ультраФильтрации диаметром 62 мм с номинальным пределом исключения 3000 (фирма-поставщик Амикон, Виттен, тип ДМ 5) промывают для стерилизации водным раствором формальдегида при скорости подачи 20 мп/ч с применением дозирующего. насоса, в течение примерно 5 ч. Затем в течение еще примерно 5 ч раствор формальдегида вытесняют дистиллированной водой. После этого также при скорости подачи

20 мл/ч в течение примерно 2,5 ч

1069622 пропускают профильтрованный через стерильный Фильтр (О, 2 мкм) раствор субстрата, содержащий 500 ммоль/л натриевой соли пировиноградной кислоты, 400 ммоль/л и 50 ммоль/л однозамещенного фосфата натрия и доведенный до рН 8 при помощи гидрата окиси натрия. После этого вместо раствора. субстрата пОдают. 10 мл раствора никотинамидадениндинуклеотида, содержащего 3,66 ммоль/л НАД+, свя- . р эанного с полиэтиленгликолем со сред. ним мол. весом 10 000 и 50 ммоль/л фосфатного буферного, раствора для ..установления рН на уровне 8. После этого снова подают раствор субстра . та этого же состава со скоростью

20 мя/ч.

Затем в реакционное пространство перед мембраной через боковое отверстие вводят 100.мг формиатдегидрогенаэы .(активность 6,74 мкмоль/мг в минуту при Формнате в качестве субстрата, 40 С и рН 8) в форме водного глицеринового раствора ((50% по весу . глицерина), 10 мг Формиатдегидроге-. назы/мл) и 1,62 мг L-аланиндегидрогеназы (активность 415 мкмоль/мг в минуту при пирувате в качестве субстрата, 40 С и рН 8) в Форме водного раствора в сульфате аммония (2,4 моль/л сульфата аммония, 5 мг З()

L-аланиндегидрогеназы/мл) при помощи шприца. При таком. составе соотношение между активностями Формиатдегидрогеназы и Ь-аланиндегидрогеназы составляет 1!1 . 3a процессом превращенияЗ5 непрерывно следят при помощи вмонти-.

: рованной в поток фильтрата проточной кюветы поляриметра. Дифференциальное давление у мембраны достигает вначале 0,2 бар, затем постепенно повыша- 4Q ется,до 0,5 бар н остается после этого постоянным. В течЕние рабочего периода, составляющего примерно 50 ч, получают 175 ммоль L-аланина. Максимальная скорость превращения достига-45 ет 6,45 имоль L-аланина/ч.

Получают 108 ммоль L-аланйна из расчета на 1 мг Ь-аланиндегидрогенаэы или 1,75 ммоль Ь-аланина из расчета на 1 мг Формиатдегидрогенаэы.

Выход целевого продукта 35%, оптическая чистота 100%. но.профильтрованный раствор, содержащий 400 ммоль/л натриевой соли пировиноградной кислоты, 800 ммоль/л

Формиата аммония и 50 ммоль/л однозамещенного фосфата натрия и установ-. ленный на уровне рН 8 при помощи гидрата окиси натрия. После этого вместо раствора субстрата при скорости подачи 4 мл/ч вводят смесь иэ 10 мл раствора коэнзима (в соответствии с.

-примером 1) и 85 мг формиатдегидрогеназы (активность 0,85 мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстрата, 25 С и рН 8) в форме водного глицеринового раствора ((50% по весу глицерина), 10 мг формиатдегидрогеназы/mr). После этого в реакционное пространство через боковое отверстие вводят при помощи шприца

0;94 мг .L-аланиндегидрогенаэы (активность 233 мкмоль/мг в минуту при . пирувате в качестве субстрата, 25 С и рН 8) в Форме водного раствора сульфата аммония (2,4 моль/л сульфа. та аммония, 5 мг L-аланиндегидроге» назы/мл) . Соотношение между активностями достигает 1:2,2. В течение

Пример 2. Стерилизацию мембранного реактора объемом 10 мл с плоской мембраной (мембрана с номинальным пределом исключения

5000, фирма-поставщик Амикон, Виттен, тип УМ 5), поддерживаемого при 25 С проводят таким же.способом, У. .60 как и в примере 1.

При скорости подачи 20 мп/ч, а течение примерно 2„5 ч подают стерильно профильтрованный раствор, содержащий 400 ммоль/л натриевой соли пиро виноградной кислоты, 400 ммоль/л фор65 миата аммония и 50 ммоль/л одноэамещенного,фосфата натрия и установлен- . ный на уровне рН 8 при помощи гидрата окиси натрия. После этого вместо раствора субстрата при скорости подачи 4 мл/ч подают смесь из 7 мл раствора коэнзима (в соответствии с примером 1) и 138 мг Формиатдегидрогенаэы. (активность 0,85, мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстрата,. 25ОС и. рН 8) в форме водного глицеринового раствора ((50% по весу глицерина), 10 мг формиатдегидрогеназы/mr}. После этого в реакционное пространство через боковое отверстие вводят 2,78 мг Ь-аланиндегидрогеназы (активность 233 мкмоль/мг в минуту при пирувате в качестве субстрата, 25 С и рН 8) в форме водного раст. вора в сульфате аммония (2,4 моль/л сульфата аммония, 5 мг L-аланиндегидрогеназы/мл) при помощи шприца. Соотношение между активностями формнатдегидрогеназы и Ь-аланиндегидрогеназы достигает 1:4. В течение 59 ч получают 48 ммоль L-аланина, что соОтветствует 17,3 ммоль L-аланина из расчета на 1 мг L-аланиндегидрогеназы или

0,35 ммоль L-аланина из расчета на

1 мг формиатдегидрогеназы. Выход целевого продукта 10,2%, оптическая чистота 100%.

Пример 3. Стерилизацию реактора объемом 10 мл с плоской мембраной (мембрана с номинальным пределом исключения 5000, фирма-поставщик амикон, Виттея, тнп уМ 5), термостатируемого при 25ОС, проводят, как описано в примере 1.

При скорости подачи 20 мл/ч, в течение примерно 2,5 ч подают стериль"

1069622

140 ч получают 92 ммоль L-аланина, что соответствует 98 ммоль L-аланина из расчета на 1 мг L-аланиндегид- рогеназы или 1,08 ммоль L-аланина из расчета на 1 мг Формиатдегидрогеназы. Выход целевого продукта состав- 5 ляет 8,2%, оптическая чистота 100%.

Пример 4. Термостатируемый при 25 С реактор объемом 11,3 мл с плоской мембраной, который снабжен магнитной мешалкой и ультрафильтра- 10 ционной мембраной диаметром 62 мм с номинальной границей исключеиия

5000 (Фирма-поставщик Амикон, виттен, тип УМ 5), промывают для стерилизации с помощью установленного на скорость подачи 20 мл/ч дозирующего насоса примерно в течение

5 ч водным 70%-ным раствором этилоного спирта вытесняют дистиллированной водой. После этого также со око- 20 ростью подачи 20 мл/ч примерно в течение 5 ч подают профильтрованный через стерильный фильтр (0,2 ммк) раствор субстрата, который содержит

100 ммоль/л натриевой соли 2-оксо- 25

4-метилпентановой кислоты и

400 ммоль/л Формиата аммония, и с помощью раствора едкого натра устанавливают рН 8. Затем в ток субстрата между дозирующим субстрат насосом и 30 стерильным Фильтром подают дозированно 11„77 мл, соответственно 35,2 мг формиатдегидрогеназы (активность

4,06 мк моль/мг в минуту в случае

Формиата в качестве субстрата, при 35

25 С и РН 8) в форме водного полиэтиленгликолевого раствора (40 вес.% этиленгликоля со средней мол. массой 400; 3 мг формиатдегидрогеназы/мл) . ! 40

Дополнительно аналогичным образом дозируют 1, 6 мл, соответственно, 6, 72 мг лейциндегидрогеназы (активность 10 46 мк моль/мг в минуту в случае натриевой соли 2-оксо-4-ме45 тилпентановой кислоты в качестве субстрата, 400 ммоль/л Формиата аммония, 25 >C и рН 8) в форме водного раствора Фосфата калия (10 ммоль/л, рН 7} . Затем следующие 5 ч дозируют раствор субстрата. После этого устанавливают скорость подачи субстрата при значении 11,3 мл/ч и добавляют 2,88 мл раствора кофермента к ферменту„ который содержит

3,92 ммоль/л НАДН, связанного с полиэтиленгликолем со средней мол. массой 10 000 в форме водного раствора, в котором с помощью раствора едкого натра установлено рН 8. При этом соотношение активностей форми-;60 атдегидрогеназы к лейциндегидрогенаэе составляет 1:2. Процесс контролируют с помощью встроенной в поток . Фильтрата проточной кюветы поляриметра. Дифференциальное давление 65 над мембраной постепенно повышается до 0,35 бар и затем остается постоянным. B течение 205 ч (8,5 дней) получают 202 ммоль Ь-лейцина . Максимальная скорость процесса составляет 1,12 ммоль L-лейцина s час. Выход целевого продукта 87,2%, оптическая чистота 100%.

Пример 5. 1ермостатируемый при 25 С реактор объемом 10 мл с плоской мембраной, который снабжен магнитной мешалкой и упьтрафильтрационной мембраной диаметром 62 мм с номинальной границей исключения

5000 (фирма-постановщик Амикон, Виттен, тип УИ 5), с помощью установленного на cKopoaTb подачи 20 MJI/÷ дозирующего насоса примерно в течение 5 ч для стерилизации промывают

70%-ным водным раствором этанола.

Затем в течение следующих 5 ч раствор.этанола вытесняют дистиллированной водой. После этого со скоростью подачи 20 мл/ч примерно в течение

2,5 ч подают профильтрованный через стерильный фильтр (0,2 мкм) раствор субстрата, который содержит

100 ммоль/л натриевой соли 2-оксо4-метилпентановой кислоты, 400 ммоль/л формиата аммония и

50 ммоль/л однозамещенного фосфата натрия, и с помощью раствора едкого натра устанавливают рН 8. Затем вмес. то раствора субстрата дозируют

7,f мл раствора кофермента, который содержит 3,80 ммоль/л НАДН, связанного с олиэтиленгликолем средней мол. массы 10 000, и 50 ммоль/л фосфатного буфера с рН 8 ° После этого дозируют 61,5 формиатдегидрогеназы (активность 2,60 мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстрата„

25ОC и рН 8) в форме водного раствора глицерина (50 вес;% глицерина;

10 мл формиатдегидрогенаэы/мп) °

Вслед за этим далее дозируют описанным образом раствор субстрата. Спустя примерно 5 ч поток субстрата уменьшают до 2 мл/ч, Затем в реакционный объем перед мембраной через боковое отверстие с помощью шприца добавляют 31,6 мг лейциндегидрогеназы (активность

11,48 мкмоль/мг в минуту в случае натриевой соли 2-оксо-4-метилпентановой кислоты в виде субстрата, при концентрации 4РО ммоль/л формиата аммония, 25 С и рН 8) в форме водного раствора Фосфата калия(10.ммоль/л

4,2 мг лейциндегидрогеназы/мл) . Соот. ношение активностей формиатдегидрогеназы и лейциндегидрогеназы составляет 1:2,3. Процесс контролируют с помощью встроенной в поток фильтрата проточной кюветы поляриметра.

Дифференциальное давление над мембраной устанавливается при значении

1069622

Составитель Ю. Хропов

Редактор Н . Егорова Техред В. Далекорей Корректор Ц Эрдейи

Эакаэ 11508/59 Тираж 410 Подписное

ВНИИПИ Росударственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, й-35, Раумская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г.уагород, ул.Проектная, 4

0,35 бар и затем остается постоянным.В течение 1152 ч (48 дней) получают

150 ммоль Ь-лейцина. Максимальная ско8 рость процесса составляет О, 20 ьвеоль ь-лейцина/ч. Йиход целевого продукта

65,1%; оптическая чистота 100%..