Способ очистки уреазы

Способ очистки уреазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(1Е (11) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

3(Д1 С 12 8 9/78

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ е вЩФ ф

"Юежч("Чж

ЙИЬМИМТЬ(А

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3411951/28-13 (22) 02.02.82 (46) 30,01.84 Бюл. Р 4 (72) Т.А.Черкасова,Ю.A.лейкин, M.M.ßíèíà, Б.И.Курганов, В.И.Богданов, С.И.дихтярев и В.Т.Чернобай (71) Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени химико-технологический инсти-. тут им. Д.И.Менделеева (53) 577.15.07 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР Р 551339, кл. С 12 и 9/00, 1977.

2. М amdouh К Kamel and Ragaa

R.Hamed. Areobacter aегоgenes PRL-R3 urease Purification and properties.

Acta biol med. germ, l975, Р 34, рр ° 971 -979 ° (54)(57) 1. СПОСОБ ОЧИСТКИ УРЕАЗЦ, предусматривающий контактирование раствора фермента с полимерным сорбентом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения степени очистки фермента, в качестве сорбента используют макропористый сополимер стиро-ла и дивинилбензола с содержанием последнего 15-40 мас.В содержащий диазогруппы в количестве 5-6,7мМ/г, 2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что используют указанный сополимер, содержащий наряду с диазогруппами сульфокислотные группы или группы алкилзамещенных фосфиновых кислот в количест- 3 ве 3,2-3,5 мМ/г.

1070162, Изобретение относится к, получе« нию высокоочищенных и активных ферментных препаратов, которые могут найти широкое применение в медицинской, микробиологической и пищевой промышленности. 5

Иэ известных способов очистки ферментов наиболее распространен хроматографический способ, основанный на применении сорбентов 111.

Наиболее близким к предлагаемому 10 является способ очистки уреаэы, предусматривающий контактирование раствора фермента с полимерным сорбентом — триэтиламиноэтилцеллюлозой с последующей десорбцией сорбированного фермента буферным раствором t.2). Степень очистки уреазы трехкратная (c 227 до 690 фе/мг белка).

Недостатком известного способа является его многостадийность и невысокая степень очистки.

Цель изобретения — упрощение процесса и повышение степени очистки. 25

Указанная цель достигается согласно способу очистки уреазы, предусматривающему контактирование раствора Фермента с полимерным сорбентом, причем в качестве сорбента испольчуют макропористый сополимер стирола и дивинилбензола с содержанием последнего 15-40 мас.В, содержащий диазогруппы в количестве

5-6,7 мМ/г.

Предпочтительно используют Укаэанный сополимер, содержащий наряду с диазогруппами сульфокислотные группы или группы алкилзамещенных фосфиновых кислот в количестве 3,2

3,5 мМ/г. 40

Перфузируют раствор уреаэы в калийфосфатном буфере с рН колонку с сорбентом в течение 4

18 ч при 4 С. При этом происходит сорбция на сорбенте балластных бел- 45 ковых примесей и повышается эффективность очистки,.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в осуществлении 50 его в одной стадии и повышении степени очистки в 5-9 раэ в случае исполь3QBBHHR сорбента, содержащего наряду с диаэогруппами сульфокислотные группы или группы алкилза- 55 мещенных фосфиновых кислот в указанном количестве.

Порометрические характеристики сополимера состава а) стирол 85 мас.%, ДВБ 15 мас.% 60 бензин порообразователь 1ООЪ от смеси мономеров. Насыпной вес

0,4-0,55 г/см,суммарный объем пор

0 35-0,75 см /г 5q 90-130 м /г Usa

0,25-0,8 мм (90%).

Ф б) стирок 60 мас.%, ДВБ 40 мас,Ъ бензин порообразователь 100% от смеси мономеров. Насыпной вес

0,3-0,36 г/см, суммарный объем пор

0,85-1,1 см /г, Ящ = 275-350 м /г, Оз<р О, 4 -1, 6 мм С9 0%) .

Пример 1. В колонку диаметром 3,6 мм, высотой 18 см помещают 2 г макропористого сополимера стирола и 40% ДВБ (в качестве порообразователя используют 100-ный бензин), содержащего в своей структуре химически активные диаэогруппы в концентрации 5,5 мМ/г и в течение 4 ч при 4ОC перфуэируют 20 мл раствора уреазы концентрацией

1,0 мг/мл в 0,1 м калийфосфатном буфере с рН 7,6. После этого сорбент отделяют фильтрованием и анализируют раствор уреазы на активность фермента. Активность уреазы увеличивается в 5,5 раза. Так удельная активность . исходной уреазы составляет 100 фе/мг (1 фе/мг — микромоль мочевины в минуту, после очистки

550 фе/мг.

Пример 2. B колонку, как описано в примере 1, загружают 2 г сорбента на основе макропористого сополимера стирола и 150 ДВБ (в качестве порообразователя используют

100%-ный бензин), содержащего в своей структуре химически активные диазогруппы в концентрации 4,5 мМ/г и в течение 4 ч при 4 С перфузируют

20 мл раствора уреазы. Удельная активность уреазы увеличивается в

5 раз. Исходная удельная активность уреаэы составляет 100 фе/мг, после очистки — 500 фе/мг.

Пример 3. В колонку, как описано в примере 1, загружают 2 r сорбента на основе макропористого сополимера стирола и 15% ДВБ (в качестве порообразователя используют

100:--ный бензин, содержащего в своей структуре химически активные диазогруппы в концентрации б мМ/г и сульфокислотные группы в концентраций 3,5 мМ/г, предварительно об.работанного 0,1 м калийфосфатным буфером до рН 7,4 в течение 18 ч при 4 С перфузируют 20 мл раствора урезы. Удельная активность урезы увеличивается в 9 раз. Исходная удельная активность уреазы составляет 100 фе/мг. после очистки

900 фе/мг.

Hp и м е р 4. В колонку, как описано в примере (91,помещают 2 х; сорбента на основе макропористого i сополимера стирола и 203 ДВБ (в ка честве порообразователя используют

80%-ный н-октай), содержащего в своей структуре химически активные диазогруппы в концентрации

6,7 мМ/г и группы Р(0)(САН)) ОН

1070162

Составитель О.Скородумова

Редактор A.Курах Техред N.Tenep КорректорИ.Эрдейи

Заказ 11642/26 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета:СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 в концентрации 3,2 ьИ/г. Сорбент обрабатывают 0,1 м калийфосфатным буфером до рН 7,4 и перфузируют

20 мл раствора уреазы, в течение

4 ч при 4 С. Удельная активность уреазы увеличивается в 6 раз. Исходная удельная активность уреазы составляет 100 фе/мг, после очистки - 600 фе/мг.

Как видно иэ приведенных примеров, использование полимерных сорбентов со стабильной диазогруппой в значительной степени упрощает процесс очистки уреазы, он осуществляется в одну стадию на типовом сорбционном оборудовании.

Варьированием рядом сорбентов, .содержащих в своей структуре просто химически активную диаэогруппу .или диазогруппу в.сочетании с сульфо- или фосфоновокислотными группами, можно значительно повысить степень очистки уреазы, увеличив ее. в 5-9 раэ.

Эффективность очистки уреазы обеспечивается эа счет ковалентного

10 связывания белковых примесей на полимерных сорбентах с -химически активными диазогруппами.

Предлагаемый способ позволяет наладить выпуск высокоактивной уреа15 зы с качеством, выше мировых стандартов.