Способ получения растворимой @ -атфазы

Способ получения растворимой @ -атфазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРИМОЙ Н -АТФАЗЫ путем освобождения митохондрий от внешних мембран в гипотонической среде,воздействия ультразвуком , экстрагирования и очистки целевого продукта высаливанием сульфатом аммоиия,о тличающийся. тем, что, с целью получения раство- , римой Н -АТФазы с большей удельной активностью, клетки головного мозга :очищают от миелина и синаптосом в градиенте плотности сахарозы 0,7 1,2 и 1,5 М, обрабатывают хлороформом и ультразвуком двукратно по 4т6 мин и затем однократно в течение 23-27 мин, а перед высаливанием сульфатом аммония проводят йзоэлектрическую преципитацию, далее пробу инкубируют при 64С, а це левой продукт повторно высаливают сульфатом аммония.

СОКИ СОВЕТСКИХ

СОЦ)4АЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (11) 3(5B G 01 N 33/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 34 0 50 1 3/2.8- 1 3 (22) 05.03.82 (46) 30 ° 01.84. Бюл. )),4 (72) Е.М;Хватова, Н.A.Hîsèêîâà и A.Ñ.Êîðÿãèí (71) Горьковский государственный медицинский институт им. С.М.Кирова (53) 615.779.94 (088.8) (56) 1. (Beec. R. В., Hudbard S.A.

Linnet P.Е., Mitchell А.D., Мцпп Е.A °

A simple aud rapid. method from the

prdaration of асепов1пе triphosphatase Еrom вцЬщ1 оспопйг1а1рагг1с1е;

Biochem.J. 1975, 148, )) 3, с. 533537) .

2. Horstman Ь.L. Racker Е. Pax tial resolution of the enzimes catalising. oxidative phosphorylation.XII, Interation betteveen mithochondrial

Adenosine Triphosphatase апй the

Protein Jnhibitor. J. of Biol. Chem.

1970, 245, 1336-1344.

3. Щипакин В .Н ., Азарашвили Т.С ., . Фролова Е.П., Евтушенко lO.Â. Выделеление и очистка мембранной аденозинтрифосфатазы митохондрий печени.—

В кн.: Биофизика живой клетки. Мембраны . Пущино, 1974, т. 5, 12-24. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧКНИЯ РАСТВОРИМОЙ Н -АТФАЗЫ путем освобождения митохондрий от внешних мембран в гипотонической среде, воздействия ультра звуком,экстрагирования и очистки целевого продукта высаливанием сульфатом аммония,отличающийся тем, что, с целью получения растворимой Н -АТФазы с большей удельной активностью, клетки головного мозга

:очищают от миелина и синаптосом в градиенте плотности сахаровы 0,7) .1,2 и 1,5 М, обрабатывают хлороформом и ультразвуком двукратно по 4-.6 мин и затем однократно в течение 23-27 мин, а перед высаливанием сульфатом аммония проводят изоэлектрическую преципитацию, далее пробу иикубируют при 64 С, а це левой продукт повторно высаливают сульфатом аммония..1070479

Изобретение относится к биохимии и может использоваться для получения растворимой Н -АТФазы из митохондрий клеток головного мозга.

Известен способ- получения растворимой Н -АТФазы из митохондрий кле5 ток сердца, включающий экстрагирование Н -АТФазы хлороформом (1).

Известен способ получения Н -АТФазы из митохондрий сердца путем разрушения их ультразвуком (2).

Известен также способ получения растворимой Н -АТФазы путем освобож. дения митохондрий от внешних мембран в гипотонической среде, воэдей- )5 ствия ультразвуком, экстрагирования и очистки целевого продукта высалива. нием сульфатом аммония (3) °

Недостатком данного способа является то, что он не приводит к выделе-2О нию Н -АТФазы в раствор из-за ряда особенностей ткани головного мозга, отличающих ее от других тканей животного организма.

Цель изобретения — получение раст" воримой Н -АТФазы из митохондрий ro»

25 лонного мозга с большей удельной активностью.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения растворимой H -АТФазы путем освобождения митохондрий от внешних мембран в гипотонической среде, гоздействия ультразвуком; экстрагировання и очистки целевого продукта нысаливанием сульфатом ar лония клетки голов- 35 ного мозга очищают от миелина и синаптосом в градиенте плотности сахарозы 0,7; 1,2 М и 1,5 М обрабатывают хлороформом и ультразнуком двукратно по 4-6 мин и затем однократ- 40 но в течение 23-27 мин, а перед высаливанием сульфатом аммония проводят изоэлектрическую преципитацию, далее пробу инкубируют при 64 С, а целевой продукт повторно Высаливают суль 45 фатом аммония.

Способ осуществляют следующим об.— разом.

Неочищенную фракцию митохондрий мозга очищают оТ миелина и синапто сом. Для этого суспензию неочищенных митохондрий центрифугируют в градиенте плотности сахарозы 0,7-» 1,2

1;5 М при концентрации белка 1520 мг/мл при 60000 д в течение

120 мин. 55 . Далее митохондрии освобождают от внешних мембран. Для этого их сус пендируют,в гипотонической среде (0,02 М трис-буфер, рН 7,5) нз рас- чета 20 мг белка/мл среды, выдерживают при 4 С 28-30 мин. Осадок суспендируют в растворе (0,9 М NaC1 и

0,02 М трис-буфер, рН 7,5) из расчета 20 мг. белка/мл среды и центрифугируют при 6000 g в течение 10* мин. данную операцию повторяют еще один

pan .

Получен ные препараты к он тролиру- ют на полному отделения внешних мемб ран методом электронной микроскопии, а также дифференци альн ой с пе кт рофотометрией по исчезновению цитохромов С и В9 °

Осадок суспендируют в среде (0,25 М сахароза, 10 мМ трис-буфер и i мМ ЭДТА, рН 7,5) . Суспензию полученных субмитохондриальных частиц (СМЧ) подвергают обезжиринанию хлороформом. Для этого к суспензии СМЧ (20-30 мг белка/мл) добавляют

0,5-0,6 объема хлороформа и легко помешивают в течение 3-4 мин. Затем смесь центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин.

Осадок обезжиренных СМЧ суспендируют в среде (0,1 М сахароза, 10 мМ трис-буФер и 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) до концентрации 18-20 мг белка/мп. Суспензию подвергают действию ультразвука на холоде в течение 4-6 мин при частоте 22 кРц и токе 40и. A на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДЧ-2Т.

Суспензию центрифугируют при

140000 g в течение 30 мин. Данную операцию проводят два раза .

Полученные ультразвуковые СМЧ разводят до концентрации 18-20 мг белка/мп среды (0,1 М сахароза, 10 мМ трис-буфер и 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) . Суспензию СМЧ подвергают действию ультразвука непрерывно в течение 23-27 мин при частоте 22 кГц и токе 40 ц А на ультразвуковом дезинтеграторе

УЗДН-2 Т. Суспензию при этом не охлаждают..

После обработки суспензию. центрифугируют при 200-250 тыс. g в течение 30 мин при температуре 18-20 .С.

Супернатант (надосадочная жидкость) используют для дальнейшей очистки

АТФазы.

Первым этапом очистки является изоэлектрическая преципитация. Для этого у супернатанта доводят рН до

5,4 l н. уксусной кислотой . Раствор центрифугируют в течение 3-5 мин при 18000 g и температуре 15-18 С.

При этом общее время выдержки рН

5,4 не должно превышать 10 мин.. У супернатанта рН доводят до 6,8-7 ед. сухим трисом.

На втором этапе очистки проводят высаливание сульфатом аммония. Для этого добавляют порошок сульфата аммония до концентрации 503 от насыщения, корректируя при этом рН трисом (6,8-7,0 ед. рН) .

Раствор выдерживают на холоде (4 С) в течение 30-35 мин а затем центрифугируют при 10000 g н течение 10 мин . Осадок растворяют в сре,пе (0,25 М сахароза, 0,001 М ЭДТА, 1070479

0,03 М АТФ и 0,01 М трис-буфер, 0,4 объема хлороформа, перемешивают

РН 7,5) . при 4 С в течение 3-4 мин. Затем

Третий этап очистки — термичес- центрифугируют 10 мин при 10000 g. кая обработка препарата. Для этого Супернатант выбрасывают. Осадок испрепараты АТФазы помещают в баню пользуют для получения УСМЧ. Общий (72 С), нагревают до 64 С и перено- 5 белок 198 мг, общая активность сят в баню (64 С), где выдерживают 116,82 мкМ фоофора/мин, удельная в течение 4 мин. Затем раствор ох- активность 0,59 мкМ фосфора/мг беллаждают при комнатной температуре ка1мин. Для получения УСМЧ осадок до 37 С и центрифугируют при обезжиренных митохондрий разводят

18000 д в течение 10 мин. Осадок 10 до концентрации 20 мг белка/мл среды выбрасывают. (0,1 М сахароза, 0,001 .М ЭДТА и

К супернатанту добавляют порошок . 0,01 М трис-буфер, РН 7,5) и затем сульфата аммония до концентрации, воздействуют ультразвуком (22 кГц, 505 от насыщения, корректируя при 40> A) в течение 4 мин на холоде, этом РН раствора сухим трисом на 15 при этом используют дезинтегратор уровне 7,5 ед. РН. УЗДН-2Т. Суспензию центрифугируют

Полученный очищенный раствор 60 мин при 140000 g и температуре

Н -АТФазы можно хранить при 4 С. 0-4 С. Осадок снова подвергают дейДля увеличения выхода АТФазы про- . ствию ультразвука в течение 4 мин водят дополнительные операции: оса- 2р це" p 4yrèpyþò 60 мин пРи 140000 g док после ультразвуковой обработки температуре 0-4 C. Осадок суспензаливают средой (0,1 М сахароза, дируют в исходной среде.

0,001 M ЭДТА и 0,01 С трис-буфер, Для экстракции Н -АТФазы ультрарй 7,5) и разводят до концентрацйи звУковые СМЧ РазводЯт до концентра20 мг белка/мл, добавляют 0 5-0<6 25 ?????? 18-20 ???? ??????????>

30 (15-18 С) 30 мин при 200000-250000 g.

Пример 1. (минимальные значе. Супернатант использУют для дальнейния параметров) . Митохондрии головно- шей очистки АТФазы. Осадок помещают

ro мозга получают, например, по мето- в холодильник (-20 С) для дальнейшеду Фонье и шомодьи. Общий белок го получения феРмента. Общий белок

4800 мг, общая активность 1632 мкМ 35 16;23 мг, общая активность 69,78 мкМ фосфора/мин и удельная 0,34 мкМ фос- фосфора/мин, удельная активность фора/мг мин. Фракцию митохондрий 4,3 мкМ фосфора/Mr белка мин. мозга суспендируют в 0,7 М холодной Очистку АТФазы начинают с изоэлектсахарозе и разводят до концентрации РиЧеокой преципитации. У суперна 8-20 мг белка/мл. Затем проводят 40 танта доводят РН 5,4 уксусной кислоцентрифугирование в градиенте плот- той (1 н) . Раствор сразу же центриности сахароэы 0,7-1,2-1,5 М (РН 7,5) Фуригуют 3-5 мин при 18000 g, осадок в угловом роторе при 600DO g в тече- выбрасывают. У супернатанта доводят ние 2 ч. Осадок представляет собой РН до 6,8-7 сухим трисом (время эксобогащенную фракцию митохондРий. 45- позиции не больше 10 мин) ° Общий беОбщий белок 320,05 мг, общая лок 3,18 мг, общая активность активность 208, 10 мкМ фосфора/мин и 15 58 мкМ Фосфора/мин, удельная акУдельная р 51 8 мкМ фосфора/мг бед» тивность 4, 7 мкМ фосфора/Mr балка мин. ка ° мин .

Затем митохондрии для. освобожде- К РаствоРУ феРмента добавляют ния от внешних мембран суспендируют сульфат аммония до конечной концентв гипотонической среде (О, 02 М трио- . рации 503 от насыщения, корректируя буфер,рН 7,5) из расчета 20.мг бел- при этом РН 7,0-7,5 трисом. Раствор ка/мл среды и выдерживают при 4 С в выдерживают 30 мин при температуре течение 30 мин. Затем раствор центри- 4 С затем центрифугируют 10 мин

Фугируют 30 мин при 10000 g. Осадок при 10000 g. Супернатант выбрасыва55 суспендируют в растворе соли (0,9 М ют, осадок растворяют в среде (0,25 М

NaCl и 0,02 M трис-буфер, РН 7,5) из сахароза, 0,001.М ЭДТА, 0,03 М АТФ и расчета 20 мг белка/мп среды и цент- 0,001 М трио-буфер, РН 7,5) до конрифугируют 10 мин при 6000 g. Эту центрации 0,5 мг белка/мл ° Раствор процедуру проводят два раза. Общнй 60 помещают в ° баню с температурой 72 С, белок 210 мг, общая активность " нагревают до 64 С и быстро переносят

134,40 мкМ фосфора/мин, удельная ак- в баню с температурой 64 С, где вытивность 210 мкМ фосфора/мг мин. За- держивают в течение 4 мин. Общий бетем в суспенэии митохондрий, лишен- лок 1,84 мг, общая активность . ных наружной мембраны, добавляют 65 22 81 мкМ фосфора/мин, удельная ак1070479 тивность 12,48 мкМ фосфора/мг белка мин.

К супефнатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 50% от насыщения, корректируя рН 7, 0-7, 5 трисом. Общая активность фермента

12,01 мкМ фосфора/мин, удельная активность 11,7 мкМ фосфора/мг белка мин, общий белок 1,68 мг.

Полученный белок обладает АТФазной активностью, устойчив к.олигомицину и ингибируется циклометилкарбодинмидом (ЦМКД) .

Пример Р 2 (оптимальные значения параметров) . Получают митохондрии из головного мозга, напри- 15 мер, по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 5406 мг, общая активность .1973 мкМ фосфора/мин, удельная активность 0,365 мкМ фосфора/мг мин. Фракцию митохондрий мозга суспендируют gp в 0,7 М холодной сахарове и разводят до концентрации 18-20 мг белка/мл.

Затем проводят центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 0,7 1,21,5 М (рН 7,5) в угловом роторе при

60000 g в течение 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную фракцию митохондрий. Общий белок 340,03 мг,общая активность 340,03 мкМ Фосфора/мин удельная активность 0,613 мкМ фосфо- 30 ра/мг белка мин.

Затем митохондрии для освобождения от внешних мембран суспендируют в гипотонической среде (0,02 M трисбуфер, рН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды и выдерживают при

4 С в течение 30 мин. Затем центрифугируют 30 мин при 10000 g. Осадок суспендируют в растворе соли (0,9 М

NaC1 и О,O2 М .трис-буфер, рН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды и 40 центрифугируют 10 мин при б тыс.

Эту процедуру проводят два раза.

Общий белок 243,96 мг, общая активность 170,16 мкМ фосфора/мин, удель ная активность 0,712 мкМ фосфора/мг 45 белка мин.

Затем к суспензии митохондрий, лишенных наружной мембраны, добавля-. ют 0,5 объема хлороформа, перемешивают и выдерживают при 4 С в тече-. ние 3-4 мин. Затем центрифугируют

10 мин при 10000 g. Супернатант выбрасывают. Осадок используют для

УСМЧ. Общий белок 210,81 мг,, общая активность 143,50 мкМ Фосфора/мин, удельная активность 0,681 мкМ фосФора/мг белка мин. Для получения

УСМЧ осадок обезжиренных митохондрий разводят до концентрации 20 мг белка/мл среды (0,1 М сахароза, 60

0,001 М ЭДТА и 0,01 M трис-буфер, рН 7,5) и затем воздействуют ультразвуком (22 кГц, 40у А) в течение

5 мин на холоде, при этом использу- ° ют дезинтегратор УЗДН-2Т. Суспензию 65 центрифугируют 60 мин при 140000 g и температуре 0-4 C. Осадок снова подвергают действию ультразвука в течение 5 мин и центрифугируют

60 мин при 140000 g и температуре

0-4 С. Осадок суспендируют в исходной среде. IP

Для экстракции Н -АТФазы ультразвуковые СМЧ разводят до концентрации белка 20 мг белка/мл среды (0,1 М сахароза, 0;001 М ЭДТА и 0,1 М трисбуфер, рН 7,5) . Затем суспЕнзию подвергают действию ультразвука. (22 кГц, 40 0 A) в течение 25 мин.

После этого,центрифугируют в тепле (15-18 С) 30 мин при 200000250000 g. Супернатант используют для дальнейшей очистки АТФазы. Осадок помещают в холодильник (-20 С) для дальнейшего получения фермента.

Общий белок 18,10 мг, общая активность 81,00 мкМ Фосфора/мин, удельная активность 4,50 мкМ фосфора/мг белка мин.

Очистку АТФазы начинают с иэоэлект рической преципитации . У супернатанта доводят рН до 5 4 уксусной кислотой (1 н). Раствор сразу же центрифугируют 3-5 мин при 18000 g осадок выбрасывают. У супернатанта доводят рН до 6,8-7 сухим трисом (время экспозиции рН 5,4 не больше

10 мин) . Общий. белок 4,31 мг, общая активность 23,26 мкМ фосфора/мг белка мин, удельная активность 4,7 мкМ фосфора/мг белка мин. К раствору фермента добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 50% от. насыщения, корректируя при этом рН

7,0-7,5 трисом. Раствор выдерживарт

30 мин при температуре 44С, затем центрифугируют 10 мин при 10000 g.

Супернатант выбрасывают, осадок растворяют в среде (0,25 М сахароза, 0,001 М ЭДТА, 0,03 М АТФ и 0,001 М трис-буФер, рН 7,5) до концентрации

0,5 мг белка/мл. Раствор помещают в баню с температурой 72 С, нагревают до 64 С и быстро переносят в баню с температурой 64 С, где выдерживают в течение 4 мин. Общий белок 2,48 мг, общая активность 39,92 .мкМ. Фосфора/мин, удельная активность 16,12 мкМ фосфора/мг белка мин. К супврнатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 50% от насыщения, корректируя рН 7,0-7,5 трисом. Общая активность фермента 31,45 мкМ фосфора/мин, удельная активность 16,01 мкМ фосфора/мг белка мин, общий белок 1,92,мг, Полученный белок обладает АТФазной активностью, устойчив к олигомицину и ингибируется ЦМКД.

Пример 3 (максимальные значения параметров) ° Получают из голов-. ного мозга митохондрии, например, по методу Фонье и Шомодьи. Общий бе1070479

Составитель И.Емельяненко

Редактор М.Рачкулинец Техред М.Тепер. Корректор Г.Решетник

Заказ 11673/42 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул .Проектная, 4 лок 5200 мг, обцая активность

1976 мкм фосфора/мин, удельная активность 0,38 мкМ фосфора/мг мин. Фракцию митохондрий мозга суспендируют в 0,7 М холодной сахарозе и разводят до концентрации 18-20 мг белка/мп. Затей проводят центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 0,7-1,21,5 М (рН 7,5) в угловом роторе при

60000 g в течение 2 ч. Осадок пред ставляет собой обогащенную фракцию fo митохондрий. Общий белок 331,0 мг, общая активность 173,77 мкм фосфо-. ра/мин, удельная активность

0,525 мкМ фосфора/мг белка.мин, Затем митохондрии для освобождения 15 от внешних мембран суспендируют в гипотонической среде (0,02 М трисбуфера, рН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды и выдерживают при 4 С в течение 30 -мин. Затем центрифугиру- 20 ют 30 мин при 10000 g. Осадок суспендируют в растноре соли (0,9 М NaC1 и 0,02 M трис-буфер, рН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды и центрифугируют 10 мин при 6000 g. Эту процедуру проводят два раза. Общий белок 224,0 мг, общая активность

154,56 мкМ фосфора/мин, удельная активность 0,69 мкМ фосфора/мг белка мин.

Затем в суспензию митохондрий, лишенных наружной мембраны (концентрация 25-30 мг/мл) доб.аляют 0,5 объема хлороформа, осторожно перемешивают и выдерживают при 4 С в течение

3-4 мин, затем це. трифугируют 10 мин при 10000 g. Супернатант выбрасывают. Осадок используют для получения ультразвуковых СМЧ. Общий белок

201,0 мг, общая активность 122,61 мкМ фосфора/мин, удельная активность 40

0,61 мкМ фосфора/мг мнн. Для получения ультразвуковых СМЧ осадок обезжиренных митохондрий разводят до концентрации 20 мг белка/мп, среды (0,1 И сахароза, 0,001 М ЭДТА и 45

0,01 М трис-буфер, рН 7,5) и затем воздействуют ультразвуком (22 кГц, 4 0+A) в течение б мин на холоде, используя при этом дезинтегратор

УЗДН-2Т. Суспензию центрифугируют

60 мин при 140000 g и температуре

0-4 С. Осадок снова подвергают действию ультразвука в течение б мин и центрифугируют 60 мин при 140000 g и температуре 0-4 С. Осадок суспен- . 5 дируют в исходной среде. Для экстракции Н» -АТФазы УСМЧ разводят для концентрации 20 мг белка/мл среды (0,1 М сахароза, 0,001 M ЭДТА и 0,01 трио- о буфер, рН 7,5). Затем суспензию под- вергают действию ультразвука (22 кГц, 40,У А) в течение 27 мин. После этого центрифугируют в тепле 15-18 С 30 мин при 200000-250000 g. Супернатант используют для дальнейшей очистки

АТФазы. Остаток помещают в холодильник (-20 С) для дальнейшего получения фермента. Обций белок супернатанта 19,21 мг, общая активность

78,76 мкМ фосфора/мин, удельная ак-. тивность 4,2 мкМ фосфора/мг мин.

Очистку АТФазы начинают с изоэлектрической преципитации. У супернанта доводят рН до 5,4 уксусной кислотой (1 н). Раствор сразу же центрифугируют 3-5 мин при 18000 g осадок выбрасывают. У супернатанта доводят рН до 6,8-7 сухим трисом (время экспо.зиции рН 5, 4 не больше 10 мин) . Общий белок супернатанта 4,58 мг, об-, щая активность 21,52 мкМ фосфора/мин удельная активность 4,58 мкМ фосфора мг „ Ê раствору фермента добавляют . сульфат аммония до конечной концентрации 503 от насыщения, корректируя при этом рН 7,0-7,5 сухим трисом.

Раствор выдерживают 30 мин при температуре 4 С, затем центрифугируют

10 мин при 10000 g. Супернатант выбрасывают, осадок растворяют в среде (0,25 М сахароза, 0,001,М ЭДТА, 0,03 М ATC и 0,001 трисбуфер, рН

7,5) до..концентрации 0,5-мг белка/мт.

Раствор помецают в баню с температурой 72 С, нагревают до 64 С и быстро переносят в баню с температурой 64 С, где выдерживают в течение 4 мин.

Общая активность фермента 12 01 мкМ фосфора/мин, удельная активность

7,8 мкМ фосфора/мг белками мин, общий белок 1,5 мг.

Полученный белок обладает АТФазной активностью, устойчив к олигомицину и ингибируется ЦМКД.

Предлагаемый способ позволяет выделять из митохондрий головного мозга растворимую Н -АТФаэу с более высокой удельной активностью (12-18 мкМ фосфора/мг мин) по сравнению с известным способом (0,5 мкМ фосфора/мг мин).