Способ получения антибиотической смеси
Иллюстрации
Реферат
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ С14ЕСИ; заключающийся в том, что проводят культивирование штамма Streptomyces roseosporus NPPIi 1137 9 в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота в минеральных солей, с последующим выделением отдельных компонентов смёсл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК.у(51) С 12 Р 21/04; С
1 47
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H ПАТЕНТУ (21) .2822004/30-15 (22),11;10 ° 79 (31) 951695 (32) 16.10.78 (33) CIQA (46) 30.01.84. Бюл. Р 4 (72) Роберт Л. Хэмилл и Марвин Мар. тин Хоен (Cm) .(7l) Эли Лилли энд Компани (СШЪ) (53) 61.5.779.9 (088.8) (56) 1. Korzybski T, et аl Antibiot1csWrig1n, Nature and Properties
v ° 1 Per@amon Press, N.X., 1967,, рр. 397-408.
2. Патент Великобритании . Р 1512568, кл. С 2. А, 01.06,78.
4 5 6 7 8 У 10 Фг тй ттСЧС (см-tJ
zs з
6 0
ФО
Я
ВИОЛОЮ _#_W
„.SU„„26 A (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТНВНОТНЧЕСКОЙ СИЕСИ р заключающийся в том, t.÷òo проводят культивирование штамма
; Streptomyces roseosporus NPPL 11379 в аэробных условиях на среде, содер;жащей источники углерода, азота в " минеральных солей, с последующим выделением отдельных компонентов смеси.
107122б б5
Изобретение относится к получению антибиотических A-21978 смесей, главным образом к получению смеси
A-21978 С, содержащей микробиологически активные родственные факторы
Cp p С., С, СЗ, С. и Су. Смеси - 5
A-21978 и A-21978 С получают погруженной аэробной ферментацией штамма
11379. Индивицуальные А-21978 С факторы разделяют и выделяют хроматографией. A-21978 и A-21978 С смеси, 3Q
A-21978 С факторы и их фармацевтически применимые соли представляют собой антибактериальные агенты и способствуют росту домашней птицы.
A-21978 С.смеси представляют собой родственные кислотные пептидные антибиотики. К данному классу антибиотиков относятся кристалломицин, амфомицин, заомицин, аспартоцин и глюамицин (. 13.
Среди укаэанных антибиотиков, как полагают, церексин A церексин В и бревестин являются антибиотиками наиболее родственными новым A-21978 С антибиотиками.
: Известен способ получения антибиотической смеси, включающий культивирование штамма 5758 или 8092 в культуральной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, в азробных условиях до ЗО достижения значительной антибиотической активности L2 ).
Однако антибиотики, полученные данным способом.,не обладают ростостимулирующей активностью для домаш- 35 них птиц.
Цель изобретения - расширение ассортимента антибиотиков.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения анти- 40 биотической смеси проводят культиви» рование штамма Streptomyces roseospo rus NPPL 11379 в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей,с последую-45 щим выделением отдельных компонентов смеси.
Пример. Фактор С A-21978 обозначен как смесь A-21978 С. Соли смесей A-21978 и A-21978 С, а также индивидуальные A-21978 .факторы С
С« С, С, С4 и Cg составляют часть изобретения.
В A-21978 С смеси факторы С„, С . и С являются основными, а факторы
Ср, С4.,è С вЂ” факторами, присутствующими в небольших количествах.
Антибиотические вещества, полученные по предлагаемому способу,произвольно обозначены как A-21978 антибиотики. Термин A-21978 антиби- 60 отики применяется в целях сокращения с тем, чтобы обозначить А»21978 и A-21978 С смеси, А-21978 факторы
Ср«, С, С4 и С>, а также их фармацевтически применимые соли.!!
Предлагаемый способ обеспечивает получение A-21978 антибиотической смеси в результате погруженной аэробной культивации щтамма Streptomyces
roseosporus NPPL 11379 или его
А-21978 производящего мутанта, а также антибиотической смеси А-21978 С.и факторов Cp С« С р Сэ и С, которые являются ее компонентами.
Изобретение предусматривает также способ получения A-21978 смеси, .который заключается в культивировании штамма Streptomyces roseosporus NPPL 11379 или А-21978-производящего мутанта в культурной среде, содержащей ассимилируемые источники карбогидрата, азота и неорганических солей, в условиях погруженной аэробной ферментации до получения значительного количества антибиотической активности.
После получения достаточного уровня антибиотической активности A-21978 смесь отделяют фильтрацией ферментационного бульона, понижают рН фильтрата до значения ниже 3, дают смеси осаждаться.и полученную смесь отделяют фильтрацией. Выделенную смесь можно подвергнуть дополнительной очистке с помощью зкстракционной техники. для выделения индивидуальной А-21978. С и факторов необходимо использовать хроматографическое разделение. А-21978 антибиотики Мнгибируют рост патогенных организмов, особенно грамположительных бактерий.
На фиг. 1-7 представлены ИК-спект- . ры (таблетки KB ) следующих А-21978 C антибиотиков (в виде натриевых солей): фиг. 1 - A-21978 смесь1 фиг.2
A-21978 С фактор С.у фиг. 3А-21978 С фактор С ;фиг.4 - A-21978 С фактор C>у фиг. 5 - А-21978 С фак:% тор Cpу фиг. 6 - A-21978 фактор С<,фиг. 7 - А-21978 С фактор С .
A-21978 С факторы представляют собой родственно связанные цептидные антибиотики. В результате ферментации.регенерируется до шести анэибиотических факторов и образуется
A-21978 смесь. Индивидуальные факторы фѫС>, С„С, и С выделяются в виде индивидуальных соединений.
А-21978 факторы представляют собой родственно связанные кислотные, циклические полипептидные антибиоти-. ки, несущие жирно-кислотную ациальную группу при концевой аминогруппе.
При гидролизе каждый из факторов образует следукщие аминокислоты, моль:
Аспартовые кислоты 4
Глицин 2
Алании 1
Серин 1
Теонин 1
Триптофан 1
107122б
Продолжение табл. 1
1 — T
CМ,З
10-Метилдодекановая кислота
5, С4
10 с
Таблица l
8-Метиллекановая кислота
10-Метил ундекановая кис", лота с.ц с1
С12
О Н
ll
С Н с — и — Т р-Asx-Asx-Th -Мо-Oen-Asx-Я0а-Азх-М -5е - AeQfx-Kyn
11 23
О Н
И I
С Н С-й-Trp-Asx-Thr-66у-Ого-Азх-Ala- A -Asx-68u-Set-Me Ggx- Kyn
11 23
Орнитин 1
Кинуренин 1
3-Метилглютамовая кислота "+ 1
"Одной из них является аспаргин.
1Н Может образовываться из 3-метилглютамина.
Каждый из A-21978 факторов содержит жирную кислоту.
В табл. 1 суммировано содержание углерода и приведена идентификация жирных кислот, содержащихся в каждом из факторов A-21978 С.
Энзимный гидролиз А-21978 фактора С при использовании карбокси2 пептидазы У подтвердил, что кинуренин представляет собой С-концевую аминокислоту и С-концевая СООН-группа может этерифицировать гидроксильную группу треонинового фрагмента.
Основываясь на вьпае приведенных данных, предполагается следующая структура A-21978 С антибиотиков
1 Азр
i-p)a о
L-ASP
Ф
Р-$ег
Ь-01 П BfG
1 ац ь-1у ,Г
А-Thr 0
eL — A8P э д. — Agp
d.- Thr
В-NH в которой 3MG представляет собой
1трео-З=метилглютамовую кислоту, Реакции деградации Эдмана показывают, что триптофан представляет собой o(,-концевую аминокислоту, а фрагмент аспартовой кислоты — следующую соседнюю аминокислоту.
Газово-хроматографическое и масс» спектральное исследование A-21978 С фактора С2 показывает, что одна из .следующих формул может описывать структуру этого фактора (Asx обозначает аспартовую кислоту или аспаргин, y MeGlx - 3-метилглютамовую кислоту или 3-метилглютамин) а R — - специальный фрагмент жирной кислоты, причем специальные R-группы.А-21978 С факторов имеют следующее значение
С 8-Иетилдеканоил
С
10-Метилундеканоил
С
l0-Метилдодеканоил
С„ C Àëêàíîèë
45 С -Àëêàíoèë
"Не идентифицировано.
A-21978 C смеси и факторы (в виде натриевых солей) растворимы в во50 де и в ки, х щелочи растворах за исключением растворов со значениями рН 3,5,в нижних спиртах, таких как метайол, этанол, пропанол и бутанол, а также в диметилформамиде, диметйлсульфоксиде, диоксане и тетрагидрофуране; но лишь незначительно растворимы или совсем нерастворимы в ацетоне, хлороформе, диэтиловом эфире, бензоле, этилацетате и углерод60 ных растворителях. Солевые формы
A-21978 С смеси и факторов. растворимы -в воде, метаноле, диметилформа миде и диметилсульфоксиде, но нерастворимы в таких растворителях, как этанол бутанол и диоксан.
1071226
В табл, 2 сумчирован приблизительный элементарный состав натриЭлемент
Вычислено Найдено
Углерод 52,61
Водород 6 07
Азот 13,63
Кислород 26,28
52, 07
52,47
6 14
5 93
12,73
25,84
13 52
26, 06
13,38
26,19
Натрий (по разности) 1 39
1 40
2,0
1,38 2,56
ПРодолжение табл. 2
Вычислено Найдено Вычислено Найдено
53,44 54,18
52,73
6,35
6,28
13 29 l3 34 . 25рбЗ : 25,06
14, 07
25,81
Натрий по разности
),07.О, 96
lt40
1 36
ИК-спектры А"21978 С смеси и факторов (в виде Na солей) в таблетках из KBr представлены на фиг. 1-7.
ИК-максимумы, см "
A-21978 С смесь С
3310
3300 3300
3050 3040
2910 2910
2840 2840
1650 1650
1540 1535
3310
3040
3300
3320
3050
3050
3050
3045
2910
2910
2910
2910 2920
2835 2850
2840
2840
2840
1655
1665
1650
1655
1650
1540
1535
1535
1525
1525
Углерод
Водород
Азот
Кислород евой соли каждого из А-21978 С факторов °
Таблица 2
Вычислено Найдено Вычислено Найдено
53,17 51,87
6,21 6,05
13,41 13,66
25,84 25,86
52,76
6 71
13р97
25,60
В табл. 3 суммированы наиболее значйтельные абсорбционные максимумы для каждого из этих веществ.
Т а б л и ц а 3
1071226
ИК-максимумы, см " (с, б4. С5
k-21978 С смесь Со
1450
1445 1450
1395 1395
1450
1455
1445
1450
1385
1395 1395
1395
1400
1310
1225
1220
1240
1215 1220
1155 1160
1060 1065
1215
1225
1160
1155
1160
11.60
1160
1065
10.65.1 055
1065
1060
735
745
745
745
745
745
740
645
518
Приблизительные молекулярные веса
I и молекулярные формулы трех основ- . ных A-21978 С факторов суммированы в табл. 4.
T.à б л и ц а 4
Продолжение табл. 5
Е, Ъ/см
35 90
36
1622
С 2 и МЬ02 1 102 (6 27
360
1636
32
33. 4О Ниже суммированы данные электрометрического титрования, определенные в ббпр-ном водном растворе диметил<формамида, для трех основных
A-21978 С факторов и A-21978 С смеси
45 (в форме а соли), рк эначения
+ °
С 5 7; 5 9; 7 2; 7,6
С " 5,8; 5,93; 7,6; 7,63
С " 5,73; 5,75; 7,54; 7,58
Смесь 5,62; 7,16 Все имеют меиьшие группы при
ll 5-12
+"Два определения у Ниже приведены вращения а-21978 С факторов (Na соли), foL)> при определении в водеф
С +11,9 (с.0,7; Н О)
С (+16,9 (с.0,7; H20)
С2 +18,6 (с.0,9; Н 0)
С +20,9 (с 0,4;. Н20)
С +14,8 (с.0,7; Н О)
65 С +17,9 (с.0,7; Н О) Н®4 6 8Zg
1650
С2
С Н.„ 61,6 02
С-74 Ню Р ц 027
15 й)6 16 27
1650
1664
О5
Е, Ъ/см т нм
307
223
300
303
62
260
41
280
В табл. 5 суммированы абсорбционные максимумы спектров УФ-.абсорбции трех основных А-21978 факторов (в форме Na солей) в нейтральном этаноле.
Т а б л и ц а 5
ПРодолжение табл. 3
Ф I
9 1071226 10
A-21978 С факторы могут быть разделены методом жидкостной хроматографии при повышенном давлении (HPLC) с использованием следующих условий: колонка: стекло, 1 х 21 сму набивка: силикагеАь (С 8 Quantum
ЬР-1); растворитель: вода: метанол: ацетонитрил (95:30:75) содержащий 0,2% уксусной кислоты и
0,23 пиридинау детектор УФ при 285 нмр давление 100 фунт/дюйм .
Времена удерживания для А-21978 С факторов (Na соли) суммированы в табл. б.
С 0,71
О 0 64
С 0,56
СЗ . 0 47
С. 0,63
С 0,53
А-21978 С факторы и A-21978 С смесь устойчивы в растворах, имеющих рН 2-9, при 5 и 25 С в течение по крайней мере 7 дн. Они цеустойчи15 вы при рН равном 11 через 4 ч (полная дезактивация) как при 5, так и при 25 С.
А-21978 С и А-21978 смеси, а .также индивидуальные А-21978 С факторы
g() Со, С.„ С« Сэ, С, и С способны к образованию солей. Эти соли использу ются, например, для разделения и очистки смесей и индивидуальных факторов. Кроме того, особенно. ценными
25 являются фармацевтически применимые соли, у которых токсичность соединения по отношению к теплокровным животным не превышает токсичности несолевой формы1
A-21978 антибиотики содержат до пяти свободных карбоксильных групп, которые могут образовывать соли, по- этому изобретение охватывает неполные, смешанные и полные соли таких соединений. При получении укаэанных солей следует избегать значений рН выше 10 из-за неустойчивости антиби,отиков при таких значениях рН.
А-21978 антибиотики содержат также две свободные аминогруппы и по«
40 этому могут образовывать моно- и дисоли присоединения кислот. Особенно ценными являются фармацевтически применимые соли щелочных и щелочноземельных металлов, аммиака, а также, соли присоединения кислот. Примерами таких солей щелочных и щелочноземельных металлов антибиотиков
A-21978 могут служить соли натрия, калия, лития, цезия, рубидия, бария, кальция и магния. Подходящие аминные соли А-21978 антибиотиков включают соли аммония, первичные, вторичные и .третичные соли С.(4-алкиламмония, а также гидрокси -C » -алкиламмониевые соли. В качестве иллюстрации аминных солей можно привести соли,; ° полученные по реакции A-21978 антибиотика с гидроокисью аммония, ме тиламином, втор, бутиламином, иэопропиламином, диэтиламином, диизо@ пропиламином этаноламином, триэтиламином., З-,амико-l-пропанолом и.т.п.
Соли A-21978 антибиотиков, в ко 1 а б л и ц а 6
966
1663
1410
1390
1246
803
А-21978 С Время, Биоаналиэ (Nicroфактор мин coccus luteus) единица/мг
A-21978 С смесь может быть отделена от факторов А-21978 А, В,.и Е при использовании силикагелевой тонкослойной хроматографии. Предпочтительной системой растворителей., является смесь ацетонитрил: вода (3:1), а предпочтительным способом детектирования является биоавтография
Приблизительные значения R (данные хроматографии указанных
A-21978 С факторов (в виде Na солей) приведены ниже:
A 0,66
В 0,57
С смесь 0,31
D 0 51
Е 0,48
Факторы A-21978 С смеси могут быть отделены друг от друга с йспользованием силикагелевой Т С с обратимой фазой (Quantum С ) . Предпочтительная система растворителей представляет собой систему вода:мета- нол:ацетонитрил (45:15:40), которая содержит 0,25 пиридина и 0,2Ъ уксусной кислоты. Для детектирования может использоваться длинноволокновый
Уф«свет (365 нм).
Приблизительные значения R
A-21978 С факторов (в виде Na costeNgr в такой системе можно записать следующим образом: торык катионами служат щелочные и щелочно«земельные металлы, получают
1071226
12 согласно общепринятым способам., применяемым для получения катионных солей. Так, например, свободно-кислотную форму А-21978 С растворяют в подходящем растворителе — теплой метаноле или этаноле. К этому раство- 5 ру добавляют раствор, содержащий стехиометрическое количество желаемого неорганического основания в водном растворе метанола. Полученную таким образом соль можно выделить )Q обычными способами, такими как фильтрация или выпаривание растворителя.
Соли, полученные с помощью органических аминов, могут быть получены аналогичным способом. Так, например, газообразный или жидкий амин можно добавлять к раствору A-21978 С факто» ра С в подходящем растворителе, таком как ацетон, а растворитель и избыток амина могут быть удалены выпариванием.
Примерами подходящих солей присое динения кислот A-21978 антибиотиков могут служить соли, полученные по . стандартной реакции с органической или неорганической кислотой, напри.мер соляной, серной, фосфорной, уксусной, янтарной, лимонной, молочной, малоиновой, фумаровой, пальмитиновой, холиовой, памовой, слизе- . вой, Р-глютамовой, Р-камфорной, глюк ЗО таровой, гликолевой, фталевой, винной, лауриновой, среариновой, салициловой, метансульфоновой, бензолсульфоновой, сорбиновой, пикриновой, бензойной, коричной и пр., 35
В ветеринарной фармацевтии хорошо известно, что обычно форма применяемого антибиотика не имеет решающего значения при лечении животного таким антибиотиком. В большинстве случаев 40 условия, существующие в организме животного, переводят лекарство в форму, отличную от той, в которой его применяли. Поэтому солевая форма, в котоРой пРименяется лекаРство, не имеет существенного зиачения. Однако солевую форму можно выбирать, руководствуясь соображениями экономии, удобства и токсичности.
Идентификация A-21978-производящего штамма.
Морфология культуры А-21978.6, которая образует А-21978 антибиотики, состоит в спорофорах, которые относятся к Rectus Flexibilis клас. сификации. Споровые цепи имеют ) 10 спор на цепь. Поверхность спор гладкая.
Культура A-21978.6 характеризуегся производством главным образом споровой массы красного цвета с 60 красновато-коричневым обратимым оттенком. Присутствует также светлокоричневый водно-растворимый пигмент. Эти характеристики получены на трех из 14 агаровых сред в ча- 65 шах (ISP ф 2, ISP 7, TPO) . Тремя средами являются именно те среды, которые подтверждают обильный воздушный и вегетативный рост.
Две .агаровые среды в чашах,ISP 3k 4 и глюкоза-испарагиновый агар производят- беловато-серую воздушную споровую массу с желтым обратимым оттенком. Водно-растворимого пигмента не наблюдают, Эти две среды демонстриру-. ют хороший, но не обильный воздушный и вегетативный рост.
Используют также девять других агаровых сред, которые„однако, дают плохой рост или совсем не дают роста и споруляции. Воздушный цвет в том случае, когда он имеется, хотя и является плохим, но относится к беловато-серой цветовой серии. ,Меланоидные пигменты отсутствуют.
Основными составляющими клеток . стенки являются LL-DAP, глицин, глюкоза и рибоза ° Все это указывает на клеточную стенку, относящуюся.к типу Х и к сахарному образцу типа
C/R (E. Buchanon, N.E. Gibbons, Ber-.
gey s Manual of Determinatire Bacteriology The Williams, Wilkins Comp. изд. 8-е, 1974, с. 658.
Следующие пять культур сравнивают в лабораторных испытаниях с A-21978.6
Streptomyces albovinaceons I P5136; ATCC. 15833
S. candidus I. P5141; АТСС 19891
S. moderatus I P5529; АТСС 23443
S. z oseosporus I P5122; ATCC 23958
S. setonii I P5395; ATCC 25497
Эти культуры принадлежат к белым и красным .цветовым сериям, имеют спорофорную морфологию RF типа, гладкую поверхность спор и в соответствии с
ISP описаниями являются меланин-отрицательными и не имеют отчетливо вы-. раженного обратимого цвета или воднорастворимых пигментов. Указанные характеристики совместно с образцом для утилизации углерода и другими вторичными отличительными признаками присущи и культуре A-21978.6.
При лабораторном испытании этих культур при сравнении с A-21978.6 четыре из них дают отрицательные результаты. S. candidus u S. setonii демонстрируют образование желтоватой воздушной споровой массы на многих средах, вследствие чего они отличаются от культуры A-21978 ° 6. S.albovinaceons u S. moderatus демонстрируют отчетливый черный обратимый цвет,, образуют водно-растворимые пиГменты и производят меланоидные пигменты.
Все это отличается от культуры
A-21978.6. Согласно предписанию ISP разновидность S. moderatus относит-, ся к красновато-коричневому или темно-коричневому обратимому цвету
13
1071226
14 вый (R) Зса
Краснова-Обиль» то-.корич-ный невый, (127)1й Оливкосветло- во-кокорич- ричненевый вый, пигмент светлокоричневый растворимый пигмент (овсяная мука на агаре)
Белый Плохой Белый (W) а (R) 5 сЬ „gy
Вегетативный:обильный (5DLO) однако такие хара.ктеристики не относятся к разновидности Я. albovinaceons. Ни одна из перечисленных куль- . тур не является меланин-положительной, Поэтому культура A-21978.6 былф классифицирована Fylcaode иог1аэ 5 и Оа11о Иапо в 1961 г Как штамм
Streptomyces ZoseospoZqs. Такая классификация основывается на срав ненни с опубликованными и прямыми лабораторным сравнениями. Следующие Щ культуральные характеристики суммируют прямые сравнительные исследования.
Культуральные характеристики.
Морфология. A-21978.6 S. roseosporus Спороформы от прямых до гибXSP4 3
Воздушный з значительный (W) а
Вегетативный: значительный (10A2) ких (RF) беэ крючков, петлей или спиралей. Цепи из более 10 спор.
Поверхность спор гладкая согласно розовый, вато се данным, полученным с помощью скани» 2О светлорующего электронного микроскопа. коричнеСпоры раствобт. продолговатыми t От продолговатых римый . отсууст- р о овальных;: до цилиндрическижз пигмент
Средний размер :25
0,85х1,78 И 1,0lz2,47 И ХЯР ф 4 (неорганические солиИнтервал крахмал на агаре)
0,65-0,97х0,97-2,6 И 0,97-1,3х1,63- Воздушный: Белый Хороший Оранже3,25 И хороший (R)3с2 ватоРост Цвет Рост Цвет 30 (Н)6 .., желтый
ВОэдуШный Серо-мор Вегетатив- Оранже- Обиль- Серохороший конная Нет Желто-ко- ныйз хоро- вато- ный желтый
Р масса ричневый ший (10В1) зеле- (1115) раствоВегета- Коричне- Хоро- Розовый, и ь Ф, . р ю ы и тивный: вый, ра-. ший растворй= 35 светло- пигмент обильный створимый мый пиг- корич- отсуст« пигмент мент от- невый вует отсутст- а сутствует раствует вориКартофельная масса 4О мый
Воздушный". Серовато- Нет Цет пигмент .хороший розовый Коричнева- ХЯР Ф 5 (глицерин-аспаргиновый
Вегетатив- Коричне- Сред- то-оран- агар) ный:обиль- вый, тем- ний жевый, Воздушный. Пурпур- Значи- Белый
HHN но-корич- раствори- 5 значимель- но-бе- тельный невый ра- . мый пиг- ный (И) 13Ьа лый створнмый . .мент от- Вегетатив- Желто- Хороший Серовато-. пигмент сутствует ный:хоро- вато- (10С2) желтый, ISP Д 1 (триптон-дрожжевой эк ший(ЗВ7) розо- светло» страктный агар) вый
Воздушный: Белый Плохой Белый
Ф умеренный CW) а вый раствори(W) а раст- мый пигВегетатив- Желтова- Плохой Желтова- вориный: хоро- то-зеле- (10В2) то-зеле- мый ший (10А1) .ный, ра- 55 пигмент створи- раство- A-21978.6 18Р®7(Я.roseosporus), мый пиг- римый. (тироэиновый агар) мент от- пигмент Рост Цвет Рост Цвет сутст отсутст- Воздушный: Желтова- Обиль- Желтовавует вует .60 обильный то-роэо- - ный то-роэоРост цвет Рост цвет (R) 5абуу вый (R) 5аВ вый
? ЯР Ф 2 (дрожжево-солодовый экст- Вегетатив- Краснова-Обиль- Желтоваракт на агаре) ный г (7L12) то-ко- ный то«коричВоэдушный Желтова- Обиль- Оранжево- модифици- ричневый,(11Е5) невый, рбильный " то-рсзо- ный желтый 65 рованный темно-ко- светло15
1071226 ричневый коричйераство- вый римый раство-. пигмент римый пигмент
Модифицированный агар Беннета
Воздушный: Нет . ОбильЖелтованет ный то-розо(R) 50В вый
Желтова- Обиль- Сероватото-ко- ный желтый, ричневый,(1104) светлораствори- коричнемый пиг- вый раст,— мент не вор имый образует- пигмент ся
Кальций-малатный агар
Вегетативный:плохой
Воздушный: Нет Плохой
Белый нет (W) а
Вегетатив- Краснова- Плохой ный: зна- то-корич.чительный невый, (7Х 12) светлокоричневый растворимый пигмент
Раствор Чапека на агаре
Желтовато-зеле- 20 ный,желтоватозеленый растворимый
1пигмент
Воздушный:.плохой (W)a, Белый Нет
ВегетативГлицерин
Воздушный: плохой
Вегетативный:обильный (SL12) -глициновый.агар
Обильный (Щ Ь
Зелено- Обильвато- ный коричне- (1053) вый,коричневый растворимый пигмент
Белый
Желтый, светлокоричне-60 вый растворимый пигмент
65, ный: плохой Белый Нет 30
Растворимый пигмент не образуется Агар Эмерсона
Воздушный". плохой Обильный Желто(R) 5 cb ваторозовый 35
Обильный Желтый, (1115) светло» коричневый
40 римый пигмент
А-21978.6
Рост Цвет Рост Цвет
Глюкоза-аспаргиновый агар
Воздушный: Белый - Значи- Белый 45 хороший тельный (W) b (W) Ь
Вегетатив- Желтый, Хороший Желтованый: хо- раство-. (12B2) то-зелероший римый: ный, (12В2) пигмент раствоне обра- римый зуется пигмент не обра.у тс 55
Питательный агар
Воэдушныйг Значинет тельный (W) Ъ
Вегетатив- Желтова- Плохой ный:пло- то-серый, хой растворимый пигмент не образуется
Белый
Желтовато-серый, растворимый пигмент не образуется
Цвет я мука
Рост Цвет Рост
Томатная паста и пшенична на агаре
Воздушный: Желтова- Обильобильный то-роэо- ный (R) 5cb вый (R) 5cb
Желтовато-розовый (12L )
Желтовато-коричневый, коричневый растворимый пигмент ф
Вегетатив- Зеленова-Обильный:обиль- то-ко- ный ный (8L12) ричневый, (12L7) коричневый растворимый пигмент углерода
A-21978
Утилизация
Субстрат
L"ÚðàáèHo3à
D-Фруктоэа
D-Галактоза
D-Грпокоза
I-Иноэит
D- Маннит
D-Раффиноэа
L-Рамноза
Салицин
Сахароза
D-Ксилоза
° 6 +
25-45
П р и м е ч а н и е. + -. положительное потребление; - — отри» цательное потребление.
Характеристика A-21978.6 ,.Меланоидные пигменты:
ХБР11 (трийтон-дрожжевой. экстракт) (пентон-дрожжевой на железистом агаре) . ХЯР 7(тирозиновый агар)
ХБРФ7 модиф.(XSP47 минус тирозин)
Тиразиновая проба
Желатиновое разжижение + +
Действие сия- Незначительный того молока гидролиз
Гидролиз крахмала, + +
Интервал рН 5-11 5-11
Температурный интерал, 0Ñ 25-40.
Восстановление нитрата +
17
1071226
Терпимость к действию йаС1, рост,до, Ъ 10
Таблица 7
Концентрация/диск, мг Класс A-21978.6
Антибиотчк
Макролид +
Лактам +
Эритромицин
Цефалотин
Линцомицин
Нистатин
Полимиксии В
Стрептомицин
Тетрациклиц
Ванцомицин
Гликозид
Полиен
Пейтид
100 ед
300 ед
Аминогликоэид +
Тетрациклин +
Гликопептид +
30
30
П р и м е ч а н и е. + - чув уст ствителен (зоны ингибирования); ойчин (зон ингибирования нет) .
NRRL 11379 и мсжет выбираться из большого числа сред. Однако в целях экономии производства, получения оптимального выхода и легкости выделения продукта некоторые культуральные среды являются предпочтитель:ными. Так, например, предпочтительным источником углерода при крупно масштабной ферментации является тапиоковый декстрин, хотя можно использовать также глюкозу, фруктоэу, галактозу, мальтозу, маннозу, масло хлопкового семени, метилолеат, глицерин, рафинированное соевое масло и т.п. Предпочтительным источником азота является энзнмно-гидролиэованный каэеин, хотя можно применять также растворимый мясной пептон,.соевую муку, соевый гидролизат, соевую крупу, дрожжи, аминокислоты, такие как L-.añïàðãèí и DL-лейцин, и т.п.
Питательные неорганические соли, которые могут вводиться в культуральную среду, представляют собой растворимые соли, способные к образованию ионов калия аммония, хлорида, сульфата, нитрата и т.п. Среди укаэанных солей особенно полезным для получения антибиотиков является K SO+ .
Могут использоваться также мелассная эола, вольный диализат и синтетические вщнеральные смеси.
Некоторые характеристики A-21978производящего S,roseosporus NRRL
11379 штамма. отлцчаются от характе- ЗО ристиК S,roseosporus. Культура
A-21978..6 отличается от указанного штамма по размеру спор, росту в морковной и картофельной массе, терпимости к NaCl и восстановлению нит- 35 рата.
Streptomyces roseosporus - культу ра, используемая для получения
A-21978 антибиотиков, депонирована и составляет часть комплекции сырьевой 4р культуры Northern Regional Research
Center, U.S. Department. of Адг1си1-.
ture, Agricultural Research Servlel, Peoria, 1111по1з 61604, откуда ее берут для использования под номером
1137 9.
Как и в случае других микроорганизмов, характеристики A-21978-производящей культуры Streptomyces rose
osporus NRRL 11379 могут подвергать1 ся изменениям. Так, например, искусственные варианты и мутанты штамма
ИНАТ 11379 могут быть получены в результате обработки различными мутагенами, такими как УФ-облучение, рентгеновское облучение, высокочастотные волны, радиоактивное облучение и обработка химическими веществами. В предлагаемом изобретении можно использовать все природные-и искусственные варианты и мутанты 60
Streptomyces roseosporus NRRL 11379, которые производят A-21978 антибио» тики.
Культуральная среда используется для роста Streptomyces roseosporud
Антибиотическая чувствительность антибиотиков представлена в табл. 7.
:цля получения А-21978 антибиотиков предцочитают использовать дистиллированную или деионизированную воду в ферментационной среде. Некоторые из минералов, содержащихся в водопроводной воде, например, таких как
19
1071226 кальций и карбонат, не способствуют получению антибиотиков.
В культуральную среду следует также нключать следовые элементы, необходимые для роста и развития организмов. Такие следовые элементы обычно 5 встречаются в виде примесей в других ингредиентах среды н количествах, . достаточных для того., чтобы удовлетворить требованиям роста микроорга-. низма. Иногда при крупномасштабной ферментации необходимо добавлять небольшие количества (например 0,2 мл/л) антивспенивающего агента, такого как полипрспиленгликоль, еслй нспенивание становится проблемой.
Для производства значительных ко- . личеств А-21978 антибиотиков предпочтительным способом является погруженная аэробная ферментация н резервуаре. Небольшие количества А-21978 ан» тибиотиков могут быть получены куль- 20 туриронанием в змеевиковой колбе.
В связи с запаздыванием времени при получении антибиотика, обычно связанным с инокулированием больших резервуаров споровой формой микроорганизмов, предпочитают использовать вегетативный принивочный материал, который получают инокулиронанием небольшого объема культуральной среды.споровой Формой мицеллиальных 30 фрагментон микроорганизма с образованием свежей, активно растущей культуры микроорганизма. Затем вегетативный прививочный материал переносят н большой резервуар. 35
A-21978-производящий микроорганизм можно ныращивать при температу рах, лежащих в интервале 20-37 С. Оптимальное получение А-21978 С имеет место в температурном интервале 40
30-32 С.
Как правило, в процессах аэробной погруженной ферментации культуральной среды через нее диспергируют стерильный воздух. Для эффективного произ- . 45 водства A-21978 антибиотиков процент насыщения воздухом при.проведении процесса в резервуаре должен иметь значение выше 20%, предпочтительно выше ЗОВ (при 30 С и давлении равном
1 атм) . 50
При Ферментации в резервуаре преД, почитают поддерживать уровень рН в ферментационной среде н интервале
6,5-7,0. Такое регулирование может достигаться в результате добавления . 55 соответствующих количеств, например, гидроокиси натрия (на ранних стадиях цроцессф) .и соляной кислоты (на более поздних стадиях).
За цолучением A-21978 анткбиоти- 60 ков в ходе ферментации можно следить путем испытания образцов бульона или экстрактов твердого мицеллия на антибиотическую активность против микроорганизмов, чувствительных к дейст- 5 вию антибиотиков. Одним из микроорганизмов для испытания таких антибиотиков, является М1сгососсиз luteus.
Биологический анализ предпочтительно осуществляют при использовании бумажно-дисковой методики на чашах с агаром.
После получения в условиях погруженной аэробной ферментации A-21978 антибиотики могут быть выделены из ферментационной среды известными в этой области способами.Антибиотическая активность, полученная в ходе ферментации A-21978-произнодящего, обычно содержится в бульоне. Поэтому максимум регенерации А-21978 антибиотиков достигается в результате первоначальной фильтрации с целью удаления мицелиальной массы. Отфильтрованный бульон может быть оЧищен различными способами с образованием
A-21978 смеси. Предпочтительный способ заключается в экстракции и осаждении с образованием A-21978 смеси.
Дальнейшая очистка и разделение
A-21978 С смеси и индивидуальных
A-21978 С факторов заключаются в дополнительной адсорбции и экстракции.
Подходящий адсорбционный материал для очистки А-21978 С смеси и факторов включает анионообменные смолы: ° сильнооснонные (полистирол, Био-Рад
AG 1 и 2, Био-Рекс, Дауэкс 1 и 2, Амберлит 1RA 400, 401, 410), умеренноосновные эпоксиполиаминные (БиоРекс 5 и Дуолит АЗОВ) и слабоосновные полистирольные или фонольные полиамины (Био-Рад AG3, Дуолит A-6, A-7, Амберлит 1RA.68, 1R 45, 1R 4В), силикагель, флоризил, полимерные адсорбенты (XAD 2 и 4), нысокопористый полимер (Диаион HP20) . Сефадекс
G-10 . G-25 и G-50, Био-Гель P-2 и
Р-10, обратимо фазовые смолы (силикагель С 8 и С ), углерод, ДЕАЕ целлюлоза и ДЕАЕ Сефадекс, полиамид, окись алюминия и микроцеллюлоза.
Источники: био-Рад и био-Гель смолы — Био-Рад Лаборатории. Ричмонд, Калифорния; амберлит и XAD смолы—
Rohm and Нааз Со Филадельфия, Ра.; дуолитные смолы — Diamond Shamrock
Chemical, Redwood City, Cal.; сефадексовые смолы — Pharmacia Fine
Chem,, AB, Uppsala Sweden; дуоксовые смолы - Dow Chemical Со., Midland, Mich. Диаион - Mitsubishi Chemical
Xndusties Ltd., Tokyo, Харап. XAD
cMomai силикагель С(ви Се = Е Merck
Darmstadt, Germany.
С другой стороны, культуральные твердые вещества, включающие компоненты среды и мицелия, могут испольэонаться без экстракции и разделения, но предпочтительно после удаления воды, в качестве источника А-21978 антибиотиков. Так, например, культуральную среду можно сушить лиофилизацией
1071226 и непосредственно смешивать в промиксе.
МИК, мг/мл
Оргаииэм (аэробный) Смесь С С., С3 С,, С
С2
Staphylococcus aureus 3055 0,13
Group D Streptococcus 282 0,25
Streptococcus pyogens 0203 0,13
1 0 0,5
0,13 0,06 0,25 0,13
0,25 0 13 1,0 0,13
2f0
170
0 25 0,13 0 13 0,25 0,13 0 06
0,13 0,25 0,13 0,5 0,06
Streptococcus pneumoniae
Park Х
Viridans Streptococcus 9943
0 13
О,5
1 0 0,5 1,0 0 18
1,0 . 0,5
0,5
Neisseria gonorshoeae
111076-4
8 0 NT 16р0 4,0 4,0 NT Nt. NT не испытаны.
Минимальные ингибиторные концен- руют некоторые бактерии согласно ис» трации, при которых A-21978 С смесь пытанню раэбавлением на агаре, суммии основные A-21978 С факторы ингиби« рованы в табл. 9.
Т а б л и ц а 9
Организм (аэробный) МИК, мг/мл
2 есь
0,5
Staphylococcus aureus 3055
1,0
0 25
0 13
Group D Streptococcus 282
0,25
2,0
1i0
0813.0,13
Streptococcus pneumoniae
Park Х
Streptococcus pyogenes с 203
0i 13
0,5
0,25
0,5
О
8 0
2,0
1,0
0,5 ь
32,0
Viridans Streptococcua
16,0
32,0
A-21978 смесь и индивидуальные
A-21978 С факторы всегда находятся в виде соли натрия, A -21978 и
A-21978 С смеси и индивидуальные
A-21978 С антибиотические факторы
Cdi Сti Cat C3i C4 H С ингибирУют
Одним иэ важных аспектов изобретения является тот факт что А-21978 антибиотики ингибируют рост микроорганизмов, являющихся устойчивыми по 60 отношению к другим антибиотикам. рост некоторых патогенных микроорганизмов, особенно грамположительных . бактерий. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК), при которых
А-21978 факторы и A-21978 С смеси ингибируют выбранные бактерии согласно установленному стандартному испытанию разбавлением на агаре, суммированы в табл. 6.
Т а л и ц а 8
В табл. 10 суммированы значения
МИК (разбавлением íà агаре)А-21978 С факторов Cyi С-р С2i С3 C4 H С5 про тив некоторых микроорганизмов при использовании методик разбавления на агаре (10) .
24
23
107 l 226
СЧ
С 3
tA
СЧ
C)
РЪ с ь.
Ю л
33Ъ (»3 с
С3.!
1О ь с
Ю
3 с Ф
tA
1О ь
СЧ л с
Ю .
РЪ, л с Ю х
Ц о
3
1
1
1
I
I
I
1 .I
1 !
1
I о
С0
ОЪ л
tCg
1.
I
I
1
I
33Ъ
СЧ с
Ю !
РЪ л с
СЧ
Ю с ь
I
l
I
СЧ
С"Ъ
CO
Ю с
Л3
Ul
Ю
CV
РЪ
ЪО.
РЪ с
С0
33Ъ с
С0
tA
СЧ с ь
СЧ
Ю с
ССЪ .
СЧ с
СЧ
Ul с
1 I 34
33Ъ
СЧ с
Ю
Ю
Ю с
Ю
° 3
СЧ л с
Ю
Ю
Ю с ь л . tA
СЧ с
Ю
Ю
Ю с
C) v
СО
t х
CO
»
CV
CA с ь
СЧ с ь
1 (1
СО с c3
° су
СЧ
1 с
C) l
Ю с Ct
IA с
Ю
ОЪ
tA
СЧ с
Ю
I (Э с .ь
СЧ Ф с
3СЪ с
С3
lA
СЧ
° «3 с .С» ь
° 3
tA
СЧ с
C)
СЧ
° «1 с
Ct о
СО
СЧ
I а
СО
tA с
C)
LA
СЧ с
I
1.
I л
СЧ л
I t3 C3 с
tA с ь
1
1
1
I
1
1
Ю с. СО.
3С) СЧ л а
ОЪ
33Ъ
СЧ с ь
СЧ с
Ю г о
С0
Сс
I
Ф, л
CO
СЧ л
Ч) ь л
tA. с
Ю.
GO с
tA с
Ю .
>в а 0
Ц Ф охх
Х (6 Оъ х
Ю Ф
СЧ
С Ъ с
CV
С Ъ
tA
l о
СЧ
С Ъ
/с
lL
43.
Ое
9 . м
43 г"
3 с !
I 1 юх . ь л ь с ч л
333 СО 3 с и ое
O t6
О-4
ot: !
4 Ф
44 C
С32 ttt
t6 Ф
6t A
Э I4
3Н ео
R И
СО ОЪ
63
О3 1
:! o оо мо оо
t» Р
36 О ео
:» х оа мо о
t4 O ч о 43
I о оою ол о
% C3t
A x ,, Фе 44 1
C3l t6
СЧ - СЧ
f c ч .ь !се 333 о
Об! О! о.ч o-. оо о
О1 Оа
Ф6 За
A III а3е !
4 б Ю ОЪ
3!! «3 14 g
mal a Ф
Сс
IA
СЧ
ЧР
С1 с ь
CO л
СЧ с
Ю t3
3 ь с
° 3
С Ъ
° 3 с
Ю х
1 Х
1 Ф
1 Х
1 36 х
1 Ф
1 Ф о
1 Х х
1 l6
1, 0) 1 (6
1 Х Н,"» СС
3 хо
6 е х.
5ц
33. Ц о 3:
Дон
tt3 Ф х Ф
3 х zoz
36 Х Ж н Р Я о е
„"хх
1 хХХ
1 36Ф оо охх
i:oõ
1 333 (6
I Хйй
36 t6 3! хаох
3ОЦНФ охн1
Ф o
333 333 Х Х оояе -е ц а
ove ххххх О Е, t3C МС )3С
25
1071226
А-21978 С антибиотики также инги- факторов С« С2, и С против. различбируют рост некоторых аэробных бак- . ных анаэробных бактерий при испольтерий. В табл. 11 суммированы актив- . зовании стандартного испытания разности А-21978 С смеси и А-21978 С бавлением на arape. таблица ll
МИК, мкг/мл
Испытуемый организм
C„C2
Смесь
101010.0510
8 . 8 1 О О 5 8.1 О lro
8 4
1,0 0,5
1,0
2 0 5 8
Hubacterium aегоfaciensPeptococcus азасспаь"", rolgticus
2 1 О
1,0 С0,5
0,5 1,0
1,0
2 О 5 <05
Peptococcus prevoti
Рер ostreptococcus
anaегоbius