Способ получения сорбента для очистки вирусных суспензий

Способ получения сорбента для очистки вирусных суспензий

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ВИРУСНЫХ СУСПЕНЗИЙ, вклю-1 чающий обработку кремнеземсодержащего материала - змишпрошиприэтоксиашаном и нитритом натрия в присутствии кислоты, о т л и ч a ю щ ии с я тем, что, с целью снижения сорбционной способности к вирусам, после обработки смесью нитрита натрия и кислоты, кремнеземсодержгщий А/ териал подвергают взаимодействию с N-винилпирролидоном или его водным раствором в присутствии соляной кислоты. ; 2. Способ по п. 1, о т л и ч a ю щ и и с я тем, что используют водный раствор N-винилаирролидона с концентрацией яе ниже 30%.

0Ю (И) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

М ЮВЭЛН

РЕСПУБЛИК (рр В 01 J .20/10; С 12 N 7/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСЯОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET COCP

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРИТИЙ (21) 3359928/23 — 26 (22) 26.11.81 (46) 07.02.84. Бюл. Р 5 (72) В. Н, Борисова, И. В. Красильников, Б. В. Мчедлишвили, Л, А Нахапетян и Л,S. Эльберт (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР и Всесоюзный научно-исследоI вательский биотехнический институт (53) 661 183:1 (088.8) (56) 1. Молодкина Л. М. и др. Методяка модифицировання макропористых кремнеземов поливинилпирролидоном. Труды института нм. Пастера "Этнология и специфическая профилактика гриппа". Л., 1979, т. 52, с. 92.

2. Мчелпишвили Б. В. и др. Жидкостная ситовая хроматография вируса гриппа as модифицированных пористых стеклах. Труды института им. Пастера "Убитая гриппозная вакцина". Л., 1976, т. 47> с. 43-49 (прототип). (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧБНИЯ СОРББНТА, ДЛЯ ОЧИСТКИ ВИРУСНЫХ СУСПЕНЗИЙ, вклю-1 чающий обработку кремнеземсодержащего матеpasas g- амннопропилтризтоксисиланом и нитритом натрия в присутствии кислоты, о т л ич а ю шийся тем, что, с пелью снижения сорбционной способности. к вирусам, после обработки смесью нитрита натрия и кислоты, кремнеземсодержащнй ьйтериал подвергают взаимодействию с N-виннлпирролндоном или его водным раствором в присутствии соляной кислоты.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что используют водный раствор й-винилпирролидона с концентрацией не ниже 30%.

10Щ 306

Изобретение относится к способу получения сорбента для очистки вирусных суспензий и может быль использовано при производстве вирусных антигенов и вакцин.

Известен способ получения сорбента для очис- 5 тки вирусных суспензий, включающий многократную обработку макропористого кремнезема раствором поливинилпирролидона с последующей

° тврмообработкой в течение 24 ч (1J.

Однако известный способ длителен. Недос- 10 таточная стабильность получаемого сорбента, обусловленная непрочной связью кремнезема, приводит к загрязнению вирусной суспензия модифицирующим агентом.

Наиболее близким к предлагаемому ио тех; 15 нической сущности и достигаемому результату является способ получения сорбента путем последовательной обработки стекла g -аминотриэтоксисиланом и смесью нитрита натрия и соляной кислоты 121. 20

Получаемый сорбент с оксипропильньтми группами сорбирувт не только примесные белки

as очищаемой вирусной суспензия, но и вирус-: ттьте частицы, что приводит к снижению выходов вируса. 25

Цель изобретения — снижение сорбционной способности к вирусам.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента дпя. очистки вирусйьтх суспенэий, включающему обработку кремнеземсодержащего материала g -аминопрон пилтриэтокеисиланом и нитритом натрия в присутствии кислоты, после обработки смесью нитрита натрия и кислоты кремнеземсодержащий материал подвергают взаимодействию с

Й-вииилпирронидоном или его водным раство35 ром в присутствии соляной кислоты.

Используют водный раствор й-вишпптирролидона с концентрацией не ниже 30 o.

Крвмнеземсодержащий материал с оксинропильными группами может быть также получен путем обработки оксипропилсиланом в виде триметилсилилового эфира или в виде эфи1та уксусной кислоты с последующим удалением защитной группы.

Пример 1 ° К 50 мл стекла МПС-.

2000 В прибавляют 50 мл 5 r-ного раствора.

g -аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне, перемешивают и выдерживают при 100 С в течение 6 ч. К модифицированному стеклу при-50 пинают 100 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты и порциями в течение 0,5 ч прибавляют раствор

2 г нитрита натрия в 10 мл воды, перемешиваюп: еще 2 ч и промывают водой. Количество окси» пропильных групп, определенное по разности . 55 исходных и не вступивших в реакцию аминогрупп, составляет 0,4 мг-экв/г. Не вступившие в реакцию аминогруппы отсутствуют.

К, 30 мл модифицированного стекла

МПС вЂ” 2000 В добавляют 30 мл й-винилпирролидона и 0,1 мп концентрированной соляной кислоты, перемешивают 2 ч, промывают водой, раствором бикарбоната натрия и снова водой.

Контроль отмывания модифицированного сорбен= та от не вступившего в реакцию .й-винилпирропидона ведут по отсутствию поглощения при

230 нм. Модифипнрованное стекло высушивают на воздухе при 604С. Содержание азота 0,59%.

В ИК-спектре имеется интенсивная полоса поглощения при 1650 см (СΠ— ИЯ).

Полученный сорбент вносят в хроматографическую колонку размером 1 х 10 см, которую уравновешивают 0 1 М rpuc-НС1 буфером с рН 7,8. В колонку вводят 1 мл алантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа А Техас, и проводят элюирование буфером, подавая его со скоростью 2 мл/минем=. На выходе колонки собирают фракции объемом 1 мл.

В 4 и 5-и фракциях элюата собирают 90 o очищенного вируса гриппа, примесныв белки и низкомолекулярные вещества элюируются в

6 — 8-и фракциях энюата. Содержание. примесного белка в очищенной суспвнзии вируса гриппа составляет 0,01 мл/мл (в исходной алаитоисной жидкости 2,5 мг/мл),степень очистки 99,6%.

Потери вирусного материала отсутствуют.

Аналогично проводят очистку вируса группы

А/Виктория 72; Выход вируса 90%, степень очис- . тки от примвсных балков 99,2%.

Исньпания модифицированного носителя показывают, что выход вируса гриппа при очистке не зависит от штамма.

При использовании оксипропилстекла ЫПС вЂ 2000В в аналогичных условиях сорбируемость вируса гриппа достигает 95%, соответственно !выход вируса составлят 5% Последующее промывание колонки 0,1 М rpuc-.НС1 буфером с рН 8,6, содержащим 0,5 М МаС1, приводит к десорбции 40% внесенного в колонку вируса. Потери вирусного материала 55%

Пример 2. При модифитцтровании стекла МПС вЂ” 1000 В в условиях примера 1 получают стекло с содержанием окснпропильных групп

0,26 мг-экв/г.

К 10 мл стекла МПС вЂ” 1000 В с содержанием оксипропильньтх групп 0,26 мг экв/г добавляют

20 мл 50 -ного водного раствора и -винилпирролидона и 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и далее обработку ведут аналогично примеру 1. Получают сорбент с содержанием азота 0,4%, который используют для выделения вируса клещеного энцефалита as культуральиой суспенэии. Для этого колонку 0,8х12 см, заполненную полученным сорбеитом, уравновешивают 0,1 М к грие-HС1 буфером с рН 8,0.

В нве вводят 1 мл вирусной суспензии и злюируют укаэанным буфером, скорость злюирова4 рролидона и 0,2 мл концентрированной соой кислоты, name обработку ведут aíaëîo примеру 1. Получают сорбент с содераннем азота 0,7%, которым загружают колону размером 0,8х12 см. Колонку уравновещиают 0,1 М фосфатным буфером с рН 8,0 вводят в иее .1 мл инактивированной суспении вируса клещевого энцефалита (иммуногеность 27 ед. ПР1в, концентрация белка

70 мкг/мл). Вирус элюирует фосфатным буром, которым колонка уравновешена, элюат обирают во фракции объемом 1 мл. В 3 и 4-й ракциях элюата собирают очищенный вирус (23 ед. HQ, концентрация белка 6 мкг/мл).

6-8-й фракциях элюируются примесные лки. Выход вируса из колонки 85%, степень чистки от белков 99,2%

Таким образом, сорбент, полученный предло-. нным способом, позволяет проводить эффекную очистку вирусных суспенэий без потерь ирусного материала с высокой степенью чистки от примесных белков °

Составитель Н. Строганова

Техред Л.Пипипенко. Корректор А, Тяско

Редактор T. Веселова

Заказ 8/4 Тираж 533

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная,4

3 1071306 ния 2 мл/минем . В 3 и 4-и фракциях элюата пи собирают вирус, в 6-8-й фракциях элюируются лян вирусные белки. Выход вируса иэ колонки 95%. гичн

Содержание примесного белка в очищенном ж препарате вируса клещевого энцефалита 5 к

0,007 мг/мл (в исходной суспенэии 1,1 мг/мл) в степень очистки 99,6%. и

При использовании оксииропилстекла в анапа-. з г". л..: гичных условиях сорбируемость вируса клещево- н . го энцефалита 50%. Соответственно выход очи- 10 8 щенного вируса составляет половину от внесен- фе

:.ного в колонку. При более жестких условиях (при использовании для элюирования вируса ф

0,1 M rpuc-HC1 буфера с рН 8,5, содержащего

0,5 M NaC1 ) десорбция вируса не наблюдается.15 В

Hp и м е р 3. К 50 мл силохрома С-80 прибавляют 50 мл 7%-ного раствора g -аминопропилтриэтокс1тсилана в ацетоне и далее процесс ведут как в примере 1, количество же оксипропильных групп 0,49 мг-экв/г, 20 тив

K 30 мл модифицированного силохрома С вЂ” 80 в добавляют 60 мл 30%-ного .раствора И-винил- - о