Способ получения конъюгата иммуноглобулина с пероксидазой

Способ получения конъюгата иммуноглобулина с пероксидазой

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА С ПЕРОКСИДАЗОЙ, предусматрива101 ,ий их взаимодействие в присутствии 0,05% глутаральдегида с последующим диализом, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, процесс взаимодействия иммуноглобули на с пероксидазой осуществляют в буферной системе, содержащей глицин, при рН 3,0 - 5,7, а после диализа реакционную смесь дополнительно обрабатывают глутаральдегидом, взятым в количестве 0,20 - 0,25 %.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К ABTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3441903/28-13 (22) 05.03.82 (46) 07.02.84. Бюл. 9 5 (72) Н. Ф, Янкина, Т.Д, Растегаева и Л.И.Ванеева (71) Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И,Мечникова (53) 577 .15(088.8) (56)1.$ ° Avzameas CoupIing of cusymes

toproteins with QIytaraIdeghyde

Immunochem. 1 969, v 6, 9 1, 43-52.

3(51): G 01 М 33/54 // A 61 К 39/395; (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪРГАТА

ИММУНОГЛОБУЛИНА С ПЕРОКСИДАЗОИ, предусматривающий их взаимодействие в присутствии 0,05% глутаральдегида с последующим диализом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, процесс взаимодействия иммуноглобули на с пероксидазой осуществляют в буферной системе, содержащей глицин, при рН 3,0 — 5,7, а после диализа реакционную смесь дополнительно обрабатывают глутаральдегидом, взятым в количестве 0,20 — 0,25 %.

1071960

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения реагента для иммуноферментного анализ а - конъюгата иммуноглобулина и пероксидазы для использования его в диаг ностике различных заболеваний. Метод

ИФА применяют для определения антител, различных антигенов, гаптенов, лекарственных препаратов, наркотиков и др. биологически активных веществ.

Известен способ получения конъюrата из иммуноглобулина и пероксидаэы с помощью глутаральдегида, заключающийся во взаимодействии пероксидазы и иммуноглобулина в присутствии

0,05% глутаральдегида в фосфатном 15 буфере, рН 6,8, с последующим диализом Г11.

Недостатком способа является недостаточно высокая активность получаемого конъюгата, в результате чего 70 он может быть использован в ИФА только при разведении 1:500-1:1000, Активность конъюгата может зависетьь от степени связывания пероксидазы с иммуноглобулином и от сероло- 75 гической активности иммуноглобулина,.

Невысокая активность коньюгата является по всей видимости следствием того, что полученный коньюгат имеет низкое содержание пероксидаэы — не более 1%, 99% пероксидаэы, очень дорогого фермента, не связывается с иммуноглобулином, Кроме этого, для получения высокоактивных коньюгатов обычно используют иммуноглобулин, полу35 ченный с помощью иммуносорбента.

Для этОго сыворотку пропускают через колонку с иммуносорбентом, антитела ,элюируют с колонки с помощью 0,1N

,глицин-НС буфера рН 2, 3, Затем полу- "0 ченный иммуноглобулин диализуют против буферной системы с рН 6,8 или нейтрализуют, добавляя Й а НРО, Концентрация иммуноглобулина для получения коньюгата должна быть не 45 ниже чем 10 мг/мл, при такой концент. рации препарата при нейтральном рН обычно 50% иммуноглобулина выпадает в осадок, который можно растворить изменив рН до 2,3. 50

Цель изобретения — повышение актив ности коньюгата, 1

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения конью(55 гата иммуноглобулина с пероксидаэой, предусматривающему взаимодействие иммуноглобулина с пероксидазой и

I присутствии О, 05% глутаральдегида с последующим диалиэом, процесс взаимо. 60 действия иммуноглобулина с пероксидазой осуществляют н буферной системе, содержащей глицин, при рН 3, О

5„7, а после диалиэа реакционную смесь дополнительно обрабатывают 65 глутаральдегидом, вэ ятым в количест ве 0,20 — 0,25%.

Предлагаемый способ позволяет повысить долю связываемой с иммуноглобулином пероксидазы, эффективнее использовать исходный иммуноглЬбулин, так как ведение процесса при более кислых значениях рН на первой стадии обуславливают его большую растворимость, устойчивость к осаждению. Это, в конечном счете, влияет на улучшение свойств, активность целевого продукта, что позволяет испольэовать последний при ИФА в значительно больших разведениях, чем препарат, полученный по известному способу.

Пример. Для получения коньюгата используют три ингредиента: иммуноглобулин (антииммуноглобулин мыши, антииммуноглобулин человека антииммуноглобулин кролика), пероксидазу, выделенную иэ хрена с

P 3,0, и альдегид глутаровой кислоты (25%). Иммуноглобулин получают с помощью иммуносорбентов, сенсибилиэиронанных предварительно иммуноглобулинами кролика, мыши, человека, Для снятия с колонки иммуноглобулинон используют 0,1М глицин-НЖ буфер (рН 2;.3) °

Полученный препарат иммуноглобулина концентрируют до 10 мг/мл. Затем 0,5 мл (с концентрацией не ниже 5 мг) н растноре 0,1 М глицин-HCl буфера (рН 2,3) прибавляют к раствору (0,5 мл) пероксидаэы (12 мг) н

0,1М фосфатном буфере (рН 6,8), полученный растнор смеси приобретает рН 5, 7, затем добавляют 0,05 мл

1%-ного раствора глутаральдегида, реакция идет при комнатной температуре в течение 2 ч, затем проводят диализ против 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,2). Этот буфер содержит следующие соли: 0,15 М NaC(I„

0,003 М КС1, 0,003 М М С1, После диалиэа вновь добавляют альдегид глутароной кислоты — 0,05 мл 5%-ного растнора (конечная концентрация глутаральдегида 0,25Ъ). Реакция идет так же, как и н первый раз, в течение 2 ч, затем проводят диализ

0,01 М фосфатного буфера (рН 7,2), Препарат коньюгата хранится как в жидком виде при 4 С, так и в лиофильно высушенном. Коньюгат, полученный этим способом, используют н ИФА при разведении 1:6000 - 1:24000, а процент связанной с иммуноглобулином пероксидазы равен 10 — 15%.

Сравнительное изучение активности коньюгатон, полученных известным способом и при использовании пероксидаэы и иммуноглобулина одной и той же серии, представлено в табл ° 1 и 2.

Как видно иэ данных табл. 1 и 2, при двукратном добавлении глутараль1071960

ТабЛица 1

Разведение коньюгата при использовании его

s ИФА

Связанная пероксидаза, Ф

Способ

Предлагаемый

Известный

1:12000

1:1600

0,8

То же (литературные данные) не больше 1,0

1:500-1 ° 000

Т а б л и ц а 2

Разведение коньюгата при использовании в

ИФА при добавлении глутаральдегида до концентрации

Способ

0.05 3

0,25 Ф рН 5,7 рН 3,0

1:100

1:1600

Предлагаемый

1!200

1:12000

1:2000

1!2400

Известный

То же (литературные данные) 1! 500

1:1000

Составитель О.Скородумова

Редактор Н.Данкулич Техред Т.Маточха KoppeicTop В.Гирняк

Эакаэ 115/37 Тираж 823 Подл исн ое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/C

Филиал ППП Патент, г,ужгород, ул.Проектная, дегида активность конфюгата возрастает, об этом свидетельствует и увеличение процента связанной пероксидазы с иммуноглобулином и увеличение объема разведения при использовании его в ИФА, Увеличение объема разведения коньюгата дает фозможность значительно снизить стоимость прове ,дения ИФА, где коньюгат является самым дорогим ингредиентом.

Способ получения глутаральдегидного коньюгата дает возможность получить более активный препарат коньюгата и позволяет полносТью испольэовать препарат иммуноглобулина беэ

50% отхода. Полученный препарат коньюгата выдерживает хранение в растворе и сушку беэ применения бычьего сывороточного альбумина.