Способ определения гуморального иммунитета

Способ определения гуморального иммунитета

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГУМОрАльного ИММУНИТЕТА путем выявле ния антигенов в сыворотке крови с помощью фотометрии, от л и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, одновременно дополнительно выявляют в сыворотке крови содержа ние антител и комплемента в единицгис активности комплемента по СН 5.0%,

(1Ю (и) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(я) А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H Astro cxoseV ca vmaexsv

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ.(21). 3378787/28-13 (22) 05. 01. 82 (46) 23.02. 84, Бюл. 9 7 (72). П.В.Барановский и И.В.Лобко (71) Тернопольский медицинский институт (53.) 615.375(088.8) (56) 1. Chudomel V °, леrkoba Е

Libausky S. Detection of leucocyte

antibodies by the., complement сопвиш-

ption test. - "Blood", 1959, 14, 920-930.

2. Авторское свидетельство СССР

Р 395086, кл. А 61. К 39/00, 1973.

3. Фримель Х. Иммунологические методы. М., "Мир", 1979, с.38-42. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 1 УИО

РАЛЬНОГО ИИМУНИТЕТА путем выявле ния антигенов в сыворотке крови с помощью фотометрии, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, одновременно дополнительно выявляют в сыворотке крови содеркание антител и комплемента в единицах активности комплемента по СН 50%.

1074530

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к иммунологическим способам диагностики, в частности к способам определения гуморального иммунитета, и в особенности может применяться для оценки такого иммунитета при наблюдении за .состоянием, развитием и течением заболевания человека и животных с чертами аутоиммунного процесса, например ревматических заболеваний хронических заболеваний легких, хронических реакций отторже ний трансплантата. "

Известны способы определения гуморального иммунитета, состоящие в раздельном определении активности комплемента и антител по уеакции потребпения комплемента f1) и f2) .

Недостатком способов является .приблизительное и неточное определение содержания антител, так как оно базируется на визуальном учете частичного гемолиза эритроцитов ба рана или 100%-го гемолиза эритроцитов в гемолитической системе, реа;, .гирующей с комплементом, несвязан-. ным .антиген-антителом. Кроме того, способы не предполагают одновременное определение уровня антител и активности комплемента. Недостатком способов явдяется также то, что содержание антител выражают в процентах разности степени гемолиэа, которую оценивают визуально в контрольных а опытных пробах, или ус- . ловных обозначениях типа "+" и

"++". Указанные недостатки не позволяют одновременно объективно судить о степени взаимЪсвязанных ком понентов единой иммунологической .реакции„ а именно антител, антигена и комплемента, на их определенйе затрачивается много времени.

Известен также способ иммунохимического определения антигенов с помощью фотометрии (3) .

Однако известнйй способ пОэвОДяет определить только один участник .гуморальной реакции, а именно антиген в условных единицах экстинции.

Целью изобретения является повышение точности и ускорения способа.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа путем выявления антигенов в сыворотке крови с помощью Фотометрии одновременно дополнительно выявляют 8 сыворотке крови содержание антител и комплемента s единицах активности комплемента по СН 50%.

Способ осуществляется следующим образом.

В три пробирки наливают по 0,1 мл исследуемой сыворотки. Первую из них

Пример. При колориметрии проб сыворотки из разведения первой пробирки (определение комплемента) получены показатели ФЭК:0,17 - в используют для определения комплемента, вторую и третью — для опреде- ления антител и.антигена. Во вторую .пробирку прибавляют 0,1 мл тканевого антигена, доведенного по белку до

5 концентрации не менее 1 г/л, в третью - 0,1 мл антисыворотки к исследуемому антигену с титром антител в PCK в пределах 1;400-1:6.00.

Антиген и антисыворотка должны быть

10 проверены на комплементарность, антикомплементарность и гемотоксические свойства. В каждую из пробирок доливают до 1,0 мл веронал-мединаповый буфер (рН 7,3) и помещают

)5 в термостат при 370C,на 45 мин. Через каждые 15 мин пробы встряхивают.

Содержимое каждой пробйрки делят на четыре порции по 0,1, 0,2, 0,3 и

0,4 мл, после чего каждую из порций

2О доводят веронал-мединаловым буфером до объема 0,5 мл и таким образом получают разведения исследуемой сыво. ротки в соотношениях 1:100, 1:50, 1:37, 5 и 1:25 (разведения подобраны 5 таким образом, что именно в этих разведениях происходит не более,, чем

50%-й гемолиз сенсибилизированных эритроцитов барана) . Затем в каждую из полученных проб прибавляют по

0,5 мл стандартизированной фотометЗо рическим способом 4%-й взвеси бараньих эритроцитов с коэффйциентом. экс-. тинции 0,86+0,01.Полученную гемолити-ческую смесь перемешивают и инкубируют 30 мин при 37 С, затем охлаждаЗ5 ют до 18-20 С (комнатной температуры) центрифугируют при 1500 об./мин в течение 10 мин. В аналогичных условиях проводят контрольные пробы с 0,5 мл веронал-мединалового буфера и 0,5 мл

40 сенсибилизированных эритроцитов барана для исключения спонтанного гемолиза. Для колориметрирования берут пробы с частичным гемолизом иколориметрируют при синем светофильтре в кювете 3,0. Серию проб для определения комплемента колориметрируют первой и определяют общую комплементарную активность сыворотки крови в единицах активности комплемента по

5п СН 50%, соотнося показатели ФЭК со степенью гемолиза эритроцитов барана по стандартной шкале гемолиза. Затем по величине экстинции, соответствующей определенному проценту гемолиза, получают активность комплемента в стандартных единицах в 1 мл сыворотки Kposa ° Затем колориметрируют пробы, обработанные антигеном и cLH тисывороткой, и по результатам колориметрии пересчитывают содержание антигена и антиген в 1 мл сыворотки..

1074530 еэы. Установлена высокая точность пособа по оценке аутоиммунного про— есса как в стадии появления антиена, так и в стадии образования анител, что позволяет вести строго фференцированную по времени й. иненсивности иммуномодулирующую теапию или обоснованно воздерживатья от.нее. . Содержание аутоантител к мйОкаральному антигену в одинаковых св.иях сывороток приведено в табл. 1.

Как видно иэ табл, 1, для серий вороток 5,6,7 и 12 определение утоантител по изв. спосббу невозжно, несмотря на их наличие.

Сравнительные данные предлагаеого известных способов приведеы в табл. 2.:

Таким образом, предлагаемый спооб. позволяет более точно (на 403) . в более короткий срок в единой истеме учета (единицах активности омплемента) одновременно опредеять все факторы гуморального ймнитета: комплементы, антиген и нтитела.

Таблица 1

Содержание по способу известному предлагае(2), % мому

16 ЕД .18 ЕД

16 ЕД

20

12 ЕД

О

4 ЕД

4 ЕД

0%.О

О

04

12 ЕД

О раэ веде нии 1: 100; О, 29 - в раэ веде- л нии 1: 50; О, 34 — в разведении 1: 37,5, О, 39 - в разведении 1г25, что соот- ц ветствует 30, 60, 70 и 90% гемолиза. z

Таким образом, в Расчет принимаются результаты колориметрии разведения, 5 ди где гемолиз не превышает .50%, т.е. в примере это разведение 1:100. Иэ р таблицы соотношений степени гемоЛи- с за и активности комплемента по ..

СН 50% находят, что активность ком- 10 ди племента в разведении сыворотки 13 . p

100 равна 0,84 Eg rto CH 50%, т.е. активность комплемента нативной сыворотки 0,84x100=84. ЕД.

При кэлориметрии сыворотки, обра- 5 ботанной антигеном (определение антител), получены показания ФЭК:0 12 » в разведении 1:100, 0,23 — в разведении 1:50, 0,30 - в разведении 1:

1:37,5, 0,55 - в разведении 1:25, что соответствует. 20, 45, 60 и 70% гемолиза..В расчет принимаются раз».. с ведения 1:100 и 1:50, что соответ« ствует активности комплемента 0,76

H 0,48 ЕД HEIR HB 1 RJl нативной cRBQ- ротки 76 и 48 ЕД, или усредненно. а

76+48=124, 124:2-62..ЕД. Зычтя величину затраты комплемента после обработки сыворотки антигеном (т.е. связывания комплемента комплексом антиген-.антитело) из общего содержания комплемента, получают величину содержания комплемента, соответствующую концентрации (содержанин) антител. При этом содержание антител выражают в той же разности - активнос- З5 . ти комплемента по СН 50%. В примере это 84-62=22 ЕД.

При колориметрии сыворотки, обработанной антисывороткой против анти» гена .(определение антигена), получе- 40 ны показания ФЗК: 0,15 - в разведении 1:100, О, .27 — s разведении 1г:50, 0,32 - в разведении 1:50, 0,32 — в; разведении 1 .37,5 и 0,36 — a разведении.1з25, что соответствует 25, 45

55, .70 и 80%- гемолиза. В расчет дрань мают разведение 1:100, чтр соответствует 0,8 ЕД или на 1мл на тинной сыворотки 80 ЕД. Разница между активностью общего комплемента 5п и его затратой поеле реакции с антисывороткой отражает содержание циркулирующего антигена в той же размерности — активности комплемента по СН 50%..В примере это 84-80=4 ЕД .Таким образом, исследована сыворот.— ка, содержащая 84 ЕД комплемента, 22 ЕД антител и 4 ЕД антигена.

16 ЕД

13 22 ЕД

14

8 ЕД

10. По предлагаемому способу выполне . но обследование 132- больных ишими- .60 ческой болезнью сердца. Исследован миокардиальный антиген и антитела к нему, а также антитела к. антигену атеросклеротически измененной, интимы .аоРты и ткани щитовидной же- 65

1074530.Таблица 2

Способ

Предлагаемый

АГ,AT,С 0,05-0,1 45 мин

По СН 50% 0,1

0,05-0,1 45 мин

0,2

0,05-0,1 90 мин

1,0

18-24 ч и+в n++n

В титре йт или Ar . 0,1

0,2

РСК

Известныйй !(3) ЕД экстин- 0,25-0,5 ции

3-20

60 мин

П р и м е ч а н и е: АГ - антиген, AT - антитела, С - комплемент; + Количество определяемого вещества s мкг/мл азота антител.

Составитель Г.Крюкова

РЕдактор О.Юрковецкая Техред A.Áàáèíåö Корректор A.ÈëüHH

Заказ 419/6 Тираж б88 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул.Проектная,4

Известный (2

Из вестный f1) Определяемые компоненты

АГ, М, СФ

Чувстви« тель ность способа, мкг/мл азота "

Время, затраченное на выполнение способа

Единицы учета ко-. нечного результата реакции

Количество сыворотки на одну пробу мл