Способ получения биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаз

Способ получения биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФРИЕСКОГО СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ АМЙНОПЕПТИДАЗ , включакяций модифт кацию нерастворимого носителя пептидным лигандом формулы H-Thr()-PhePro-OH , отличающийся тем, что, с целью увеличения емкости и повышения устойчивости сорбента к действию микроорганизмов и (ферментов, в качестве нерастворимого носителя используют N-глициламиносилЛхром . ko 4::а ОС 1

СОКИ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

М9) (111

ЗСЮ С 07 E 7

0948, Ф

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3297222/23-04 (22) 09.06.81 (46) 23.02.84. Бюл. Р 7 (72) В.М. Степанов, Л.A. Люблинская, Т.И. Ваганова, М.П. Юсупова, Н.М. Иванова и Е.С. Оксенойт (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (53) 577. 15,07 (088. 8) (56) 1. Туркова Я. Аффинная хроматография. М., 1980, с. 15.

2. Заявка Великобритании

М 1492829, кл. С 3 Н, 1977.

3. Люблинская Л.A., Ваганова Т.И., Оксенойт Е.С., Баландина Г.Н.

Филиппова И.Ю. и Степанов В.М. Биоспецифическая хроматография лейцинаминопептидазы Aspergillus oryzae.

Тез. Всесоюзного симпозиума. Методы получения высокоочищенных ферментов.

Вильнюс, 1978, с. 84 (прототип).

4. 111редер Э., Любке К. Пептиды.

N., 1967, т. 1.

5. Иванова Н.М., Ваганова T.И.

Стронгин A.ß. и Степанов В.М. Выделение и свойства лейцинаминопептидаз из Asp. oryzae, Биохимия, 42, 843, 1977.

6. Fittkau S, Schunck W.-Н., Mgotsi S. Versuche zur Affinitstsmarkierung der Leuzinaminopepti6ase

mit neuen substratanalogen Inhibitogen. Acta biol. пей. germ, 35, 365378 1976. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО COPBEHTA ДЛЯ ОЧИСТКИ АМИНОПЕПТИДАЗ, включающий модификацию нерастворимого носителя пептидным лигандом формулы Н-Thr(OBu+)-Phe.Pro-0Н, отличающийся тем, что, с целью увеличения емкости и повышения устойчивости сорбента к действию микроорганизмов и ,ферментов, в качестве нерастворимо го носителя используют N-глициламиносилохром.

1074877

Изобретение относится к способу получения нового биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаэ и может найти применение в биохимии, медицине и прикладной микробиологии..

В настоящее время наиболее перспективным для избирательной очистки ферментов является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам бустрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, что позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а потому дос- 15 тигать более высокой степени очистки по сравнению с другими видами хроматографической техники f1/ .

Известные в настоящее время биоспецифические сорбенты для очистки, 70 амйнопептидаз представляют собой нерастворимые носители — производные целлюлозы, агарозы или метилметакрилата, к которым ковалентно присоедИнен лиганд, специфичный для аминопептидаз (2) и (3g .

Известен сорбент для очистки аминопептидаз который получают путем присоединения к "сферону 300", содержащему ковалентно присоединенный гексаметилендиамин, D-лейцина, с использованием в качестве конденсирующего реагента водорастворимого карбодиимида. Этот сорбент позволяет проводить выделение аминопептидаз со степенью очистки в 6,4 раза.

Недостатком этого сорбента является его малая избирательность, что не позволяет получать ферменты с высокой степенью очистки.

Наиболее близким к изобретению 40 по технической сущности и достигае лому результату является способ получения биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаз, заключающийся в ковалентном присоединении 45 к и-фенилендиамин-сефароэе 4В пептидного ингибитора аминопептидаз

Н-Thr(OBu )-Phe -Pro-OH, 50

Синтез биоспецифического сорбента осуществляют согласно следующей

60 схеме

Известный сорбент позволяет выделять лейцинаминопептидаэу иэ

As@, oryzae со степенью очистки в

20 раз (3) .

Однако известный сорбент обладает низкой емкостью — 0,36 мкмоль пептида на 1 мл сефарозы, так как известный способ позволяет получать сорбент только с низким содержанием трипептидного лиганда, поскольку реакция ацилирования и-фенилендиамин-сефарозы 4В проводится с помощью водорастворимого карбодиимида а незамещенным трипептидом. Другим недостатком известного способа является использование в качестве нерастворимого носителя производного агарозы — и-фенилендиамин-сефароэы

4В которая легко разрушается под действием гликоэидаэ — ферментов, часто присутствующих в микроскопических грибах и бактериях, являющихся источником выделения аминопептидаэ. Это обстоятельство исключает воэможность применения сорбента, получаемого по известному способу, на ранних стадиях выделения фермента.

Целью изобретения является получение биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаэ, обладающего высокой емкостью и устойчивостью к ферментам и микроорганизмам.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаз, который заключается в том, что в качестве нерастворимого носителя используют И-глицил-аминосилохрома.

Исходный N-глицил-аминосилохром получают путем присоединения к аминосилохрому С-80 бенэилоксикарбонилглицина с помощью известных методов образования амидной связи. в частности с помощью карбодиимидного метода, метода "смешанных ангидридов", метода "активированных эфиров" и т.д. (4) .

Непрореагировавшие аминогруппы силохрома блокируют путем ацетилирования. Затем отщепляют защитную бенэилоксикарбонильную группу от остатков глицина. К N-глицил-аминосилохрому с помощью любого известного метода образования амидной связи в частности карбодиимидного, метода активированных зфиров или метода смешанных ангидридов присоединяют защищенный трипептид формулы NPS-Thr jOBu )-Phe1

Pro-OH, синтезированный путем ацилирования известного пептидного ингибитора аминопептидаэ — Н-Тhr(OBu )—

-Phe-Pro-OH j6) c o -нитрофенилсульфенилхлоридом. Непрореагировавшие аминогруппы N-глициламиносилохрома .блокируют обработкой нитромочевиной.

Завершающей стадией синтеза биоспецифического сорбента является удаление о-нитрофенилсульфенильной защитной группы обработкой тиомочевиной.

1074877

НВг/ (cOH — -ль

Ас«О

-NHg

-йн, ян — нн — со — сн

-NH-01ф-Н

-NH-Gly-Й

9Н" е-Thr -NPS

« «с««««

15 обрабатывают 0,84 мл триэтиламина в

20 мл хлорофоргла в течение 5 мин, промывают 20 ил хлорофоргла и снова обрабатывают в течение 5 мин 0,42 мл триэтиламина в 20 мл хлороформа. Затем смолу промывают хлороформом (Зх20 глл} ДМФА (Зх20 г л) прибавляют 1,66 г ИРБ-Thr(OBu Phe-Pro-H

У . Ф в 20 мл ДМФА и через 5 мин 600 мг дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 2 ч при комнатной температуре и оставляют на ночь. Смолу промывают >1ФА (бх10 мл). и этанолом (5х20 ил). Повторяют обработку смолы

0,328 r NPS-Thr(OBu )-Phe-Pro-ОН и

0,206 r дициклогексилкарбодиимида в

20 мл ДМФА. Далее смолу, промытую хлороформом (Зх10 мл), обрабатывают

0,088 мл триэтиламина в 10 мл хлороформа. Через 5 мин сглолу промывают хлороформом (Зх10 мл) и этанолом

35 (Зх10 ил). Прибавляют 0,01785 г нитромочевины в 10 мл этанола и перемешивают 2 ч на водяной бане при

45 С. Промывают 10.мл этанола и повторяют обработку нитромочевиной.

4р Смолу промывают абсолютным метанолом (3x10 мл) и смесью метанол-уксусная кислота 4:1, обрабатывают 0,910 r тиоиочевины в 10 мл смеси метанолуксусная кислота 4:1 в течение

45 5 мин при комнатной теглпературе и перемешивании. Смолу проиывают метанолом (4х10 мл) и хлористым метиленом (3x10 мл). Содержание пептида составляет 92 мкмоль/г сухого сор50

В таблице приведены данные по очистке аминопептидаз с помоглью

Н-Thr(OBu )-Phe-Pro-Gly-аминосило1 хрома. В экспериментах использован

} коммерческий препарат амилооризина

П 10х, который был подвергнут предварительной очистке активированным углем и хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе A-50, экстракт поверхностной культуры Trichoderrna sp., который

60 был осажден сульфатом аммония и подвергнут гельфильтрации на Акрилексе P-бо, а также диализованная культуральная жидкость Вас. thurihgiensis. (оличество нанесенного

65 и элюированного белка измерено в

-NHg

+ Z-Gly-OH -NH-Gly-Z

-NH-01у-Z

NPS-Thr (OBu ) -Phe-Pro-ОН

Н NCONHNOg -NH-CO-CH

Ф

— NH — Gly — P o — Ph

-NH-Gly-ННСОНН

-ян-со-сн1

Ви

Ф

-NH-Gly-Pro-Phe- hr-H

-NH-Gly-NHCONH где Z — бензилоксикарбонил;

NPS — о-нитрофенилсульфенил;

OBut — трет-бутил.

Предлагаемый сорбент содержит

92 мкмоль трипептида на 1 г сухого сорбента.

Ч р и и е р 1. Получение

H-Thr(OBu )-Phe-Pro-Gly-аминосило1 хрома.

5-г аминосилохрома С-80 с содержанием аминогрупп 400 мкг-экв/г сухой смолы суспендируют в 20 мл диметилформамида (МДФА), через 5 мин

ДМФА декантируют, к смоле прибавляют

0,84 мл триэтиламина в 25 мл ДЕФА, выдерживают 5 мин и удаляют раствор триэтиламина декантацией. Сглапу промывают 25 мл ДМФА, растворитель декантируют и повторяют обработку

0,42 мл триэтиламина в 25 мл ДМФА в течение 5 мин. Раствор триэтиламина декантируют, проглывают смолу

ДМФА (3 раза по 20 мл) и прибавляют

1,254 г бензилоксикарбонилглицина:. в 20 мл ДМФА и через 5 мин прибавляют 1,236 г дициклогексилкарбодиииида. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, повторно обрабатывают тем же количеством бензилоксикарбонилглицина и дициклогексилкарбодиимида и оставляют на ночь. Затем смолу отфильтровывают, промывают ДМФА (3x25 мл), этанолом (Зх25 мл-), хлористым метиленом и эфиром (по Зх20 ил).

Затем смолу снова суспендируют в 20 ил абсолютного ДИФА, обрабатывают 1,75 мл триэтиламина и через

3 мин вносят 1,17 мл уксусного анги- дрида, после перемешивания в тече ние двух часов при комнатной температуре смолу промывают ДМФА (3x20 мл этанолом (3x20 мл), хлористым метиленом (3x20 мл) и эфиром (3x20 мл}.

Затем смолу промывают ледяной уксусной кислотой (3x20 мл) и обрабатывают 20 мл 40%-ного бромистого водорода в ледяной уксусной кислоте в течение 30 иин при комнатной темпера туре. Далее смолу промывают ледяной уксусной кислотой (Зх20 мл), этанолом (Зх20 ил) хлористым метиленом (Зх20 ил), хлороформом (Зх20 мл), Нн-СО-СН

-нн-Gly-z

-NH-Gly-Z

NH-co-сн4 о

t.

-NH-Gly-Pro-&he-Thr-NPS

-НН Gly-Н

1074877

Нанесение

Выход, %

Очистка в и раз

Элюирование

Препарат

Белок Активность

Активность

Велок

Белок о.е., " 808М

Активность о.е.

?80ю

Удельная, мкмоль

Удельная мкмоль бщая, кмоль

Общая, мкмоль мин н

A мин

Appal мин

Полученный на основе Asp. oryzae 52,2

13,6 0,258 1 8 9,2

5,06 3,45 67,5 19

Полученный на основе

Trichoderma яр. 1800

7,0 0,004 50,0 4,0

0,08 2,8 57,1 20,5

Днализованная .культуральная жидкость, полученная выращиванием Вас.

thuringiensis

190 49,0 0,258 13,0 30,0

2 3 6,85 61,0 9

Составитель О. Галкин

Редактор Г. Волкова Техред Л;Пилипенко Корректор С, Шекмар

Заказ 453 23 Тираж 381 Подписное

ВНИИПИ .Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 условных оптических единицах, т.е, .в единицах оптической плотности при .

280 нм. Активность Ферментов измерена по скорости гидролиэа и-нитро(анилида Ь-лейцина Я . Степень очистки ферментных препаратов характеризуется удельной активностью,т.е. количеством мкмолей расщепленного субстрата в минуту на количество белка, выраженное в оптических единицах. Степень очистки определяет- 10 ся отношением удельной активности полученного препарата к удельной активности исходного раствора Фермента . Таким образом, как видно иэ таблицы, полученный сорбент поэво- 15 ляет очищать с выходом 57-67% аминопептидазы микробиологического происхождения с увеличением активности в 9-20 раз в зависимости от чистоты исходного препарата. Сорбент обла- 7О дает устойчивостью к микроорганизмам и ферментам и эффективен как при извлечении аминопептидаз иэ частично очищенных коммерческих препаратов, так и непосредственно из культуральной жидкости. Вследствие высокой избирательности сорбента значительный эффект достигается в одностадийном процессе очистки.

Сорбент может быть использован для работы многократно (не менее

35 раз) в течение года с растворами в широком диапазоне рН от 5,6 до

8,9, где аминопептидазы наиболее стабильны. Тогда как использование аналогичного аффинного сорбента, где матрицей служит сефароза 4В, для очистки аминопептидаз из препаратов

Trichoderma и ряда видов Aspergillus приводит, как правило, к полному гидролизу носителя эа один — два цикла выделения фермента.

Кропиле того, предлагаемый сорбент, обладает более высокой по сравнению с известным сорбентом емкостью, за счет более высокого содержания пептидных лигандов на 1 г полимера.