Способ выделения полинуклеотидфосфорилазы

Способ выделения полинуклеотидфосфорилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗЫ из Escherichia coli,включающий разрушение клеток в присутствии дезоксирибонуклеазы. .ft-t. I и и ,: iiHlkJtttOTKK отделение бесклеточного экстракта, хроматографию его на диэтиламиноэтил целлюлозе, концентрирование фермента в полученном элюате сульфатом аммония и сорбцию полинуклеотидФосфорилазы на сорбенте с последующей элюцией , повторным концентрированием фермента в элюате с помощью сульфата аммония и гельфильтрацией, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве сорбента используют альдегидосилохром, ковсшентно связанный с лигандом красителем процион ярко-голубой М- , причем сорбцию-фермента ведут в среде буфера рН 8,9-9,1, содержащего 0,9-1,1 М КСЕ и 5-15 мМ Mgce , а элюцию осуществляют бессолевым бу (Л фером рН в,9-9,1. 2. Способ по п. 1, отличающий с я . тем, что разрушение клеток проводят лизоцимом в присутствии Тритона Х-100.

COt03 СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЯИН

П9) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3351298/28-13 (22) 11 ° 07,81 (46) 28.02.84. Бюл. 9 8 (72) С.Н. Загребельный, A.È. Закабунин, В.П. Романов и В.П. Кумарев (71) Специальное конструкторско-технологическое бюро биологически активных веществ и Институт цитологии и генетики СО .АН СССР (53) 577 ° 15(088.8) (56) I ° Portier С. Rapenhusch R. чаи, Thang M.N., Grunberg Manago M. Eur.

J.Bi.ochem 1973, 40, 77.

2. Drocourt J.L., Thang D.Ñ., Thang М.N. Eur. J. Biochem, 1978, 82, 355, 3. Кумарев В.П. и др. Биоорганическая химия, 1976, М 2, с. 100. (54)(57) 1, СПОСОБ ВЫЦЕЛЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗЫ из Escherichia

coIi,âêëþ÷àþùèß разрушение клеток в присутствии дезоксирибонуклеазы, 3(51) С 12 N 9/14; С 12 R 1/19 отделение бесклеточного экстракта, хроматографию его на диэтиламиноэтилцеллюлозе, концентрирование фермента в полученном элюате сульфатом аммония и сорбцию полинуклеотидфосфори.лазы на сорбенте с последующей элюцией, повторным концентрированием фермента в элюате с помощью сульфата аммония и гельфильтрацией, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве сор- бента используют альдегидосилохром, ковалентно связанный с лигандом— красителем процион ярко-голубой Мпричем сорбцию-фермента ведут в среде буфера рН 8,9-9,1, содержащего

0,9-1,1 М КС8 и 5-15 мМ MgCP, а @ элюцию осуществляют бессолевым буфером рН 8,9-9,1.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся . тем, что разрушение клеток проводят лизоцимом в присутствии Тритона Х-100.

1076445

О БН

Я0 1Ча ОН

1Ч=(1ЧН-ф Я

805%а 1ЧН

О ЫН

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам получения высокоочищенных ферментов, и может быть использовано для выделения и очистки полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы) с последующим применением фермента для синтеза высокомолекулярных гомон гетерополирибонуклеотидов и ряда других биохимических исследований.

Полинуклеотидфосфорилаза является ключевым звеном работ по получению 1р двухспиральных комплексов полирибонуклеотидов, являющихся наиболее эффективными невирусными индукторами .интерферона.

Известен ряд способов получения 15 высокоочищенной полинуклеотидфосфорилазы, пригодной для иммобилизации и синтеза высокомолекулярных полирибонуклеотидов. Большинство этих способов основано на использовании хроматографии на ионообменных сорбентах, гель-фильтрации, солевого фракционирования .белков, высокоскоростного центрифугирования и незначительно различаются между собой. - 75

Известен способ выделения полинуклеотидфосфорилазы, включающий следую. щие последовательные стадии: получение грубого экстракта биомассы

Escherichia coIi В., денатурацию примесных белков прогреванием экстракта, удаление нуклеоновых кислот фракционированием на ДЗЙЭ-целлюлозе, концентрирование белка сульфатом аммония, фракционирование фермента сульфатом аммония, удаление сульфата аммония дйализом, хроматографию фермента на ДЭАЭ-сефадексе A-50, концентрирование фермента сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексе Г-200, концентрирование ультра- . 4р фильтрацией на фильтрах ХМ-50 (1) .

Данный способ дает очистку в 210280 раз. Основным недостатком способа является многостадийность и длительность процесса очистки. 45

Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения полинуклеотидфосфорилазы из Escherichia

coIi, включающий разрушение клеток путем растирания с окисью алюминия 5ð с последующей обработкой дезоксирибонуклеазой, отделение бесклеточно-. го экстракта, высокоскоростное цент рифугирование при 100000 g, фракционирование его хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе, концент55 рирование фермента в элюате сульфатом аммония, фракционирование белков сульфатом аммония, диализ, сорбцию фермента на диэтиламиноэтилсефадексе A-50 при рН 7,5 в градиенте

NaCI с последующей элюацией, концентрирование сульфатом аммония и гель-фильтрацией, после чего проводят концентрирование ультрафильтрацией и аффинную хроматографию на zoлубой декстран-сефарозе в градиенте концентрации КС8 (0-1,0 М) или поли (И) (0,1 мкМ) 32(Указанный способ является многостадийным и трудоемким. Кроме того, недостатком является использование аффинной хроматографии Фермента, уже имеющего высокую степень чистоты (удельная активность ПНФазы

700 ед.акт./мг) . Это не позволяет реализовать преимущества метода аффинной хроматографии для очистки фермента ° Кроме того, голубая декст ран-сефароза и BrCN-сефароза, используемая для получения,аффинного сорбента являются труднодоступными импортными реактивами, а использование полиинозиновой кислоты для элюции фермента с голубой декстран-сефарозы требует проведения дополнительных стадий очистки фермента от полинуклеотида, который загрязняет препараты.

Цель изобретения †.упрощение способа получения полинуклеотидфосфорилазы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения полинуклеотидфосфорилазы из Escherichia

coIi, включающему разрушение клеток в присутствии дезоксирибонуклеазы, отделение бесклеточного экстракта, хроматографию его на диэтиламиноэтилцеллюлозе, концентрирование фермента в полученном элюате сульфатом аммония и сорбцию полинуклеотидфосфорилазы на сорбенте с последующей элюцией, повторным концентрированием фермента в элюате с помощьв сульфата аммония и гельфильтрацией, в качестве сорбента используют альдегидосилохром, ковалентно связанный с лигандом — красителем процион ярко-голубой М-В, причем сорбцию Фермента ведут в среде буфера рН 8,9-9,1, содержащего 0,9-1,1 М КС6 и 5-15 мМ

MgCIg, а элюцию осуществляют бессолевым буфером рН 8,9-9,1.

Обычно разрушение клеток проводят лизоцимом в приоутствии Тритона Х-100.

Используемый в качестве сорбента процион-силохром имеет формулу

1076445 и содержит в качестве лиганда ковалентно связанный с альдегидосилохромом остаток красителя проциона яркоголубого М-((структурного аналога цибакрона ЗС вЂ” A. Связь между красителем и матрицей осуществляется через 3,3-диаминобензидиновый мостик.

Использование в качестве аффинного сорбента процион-силохрома позволяет проводить сорбцию полинуклеотидфосфорилазы в присутствии 0,9-1,1 М 10

KCg и 5-15 мМ MgCC<при рН 8,9-9,1, а элюцию вести.при том же рН в отсутстВии КСЕ и MgC(!< . B этих условиях отделение основной части балластных белков происходит. уже при 15 нанесении образца на аффинный сорбент. Выбранные условия хроматографии на аффинном сорбенте значительно сокращают время ее проведения и упрощают аппаратурное оформление стадии.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки Е. coIi MPE-600 разрушают лизоцимом в присутствии Тритона

Х-100 и панкреатической ДНКазы, не обходимой для гидролиза освобождающейся ДНК и, как следствие, для уменьшения вязкости раствора, что облегчает дальнейшее проведение очистки. Полученный грубый экстракт наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой и элюируют фермент 0,15 M KC(! ° Из фракции, содержащих фермент, осаждают белок добавлением сухого сульфата аммония до степени повышения

0,6-0,8. После растворения фермент наносят на колонку с процион-силохромом в-присутствии 0,9-1 1 М КС и 5-15 мМ MqCO, что обеспечивает удаление балластных белков. Элюцию 40 фермента осуществляют при рН 8,99,1 бессолевым буфером, содержащим

50 мИ трис-НСГ; 0,5 мМ ЭДТАу 0,2 мМ

ДТЭ; 5Ъ.глицерина.

После элюции фермента его можно 45 концентрировать сульфатом аммония и фракционировать на биогеле А 1,5 М.

Фермент, полученный на этой стадии, может быть использован для синтеза полирибонуклеотидов без дополнительной обработки.

Получаемый по предлагаемому способу фермент имеет 240-кратную очист ку и удельную,активность

470 ед. акт./мг. Фермент электрофоретически гомогенен.

Пример 1. Получение аффинного сорбента.

Для получения аффинного сорбента используют альдегидосилохром, синтезированный по методу )3) . с исполь- 60 зовснием широкопористого силохрома

С-1.

Суспензию 1 r альдегидосилохрома в 7-10 мл Н О обрабатывают 20 мкмоль

3,3-диаминобензидина при 80-90 С в течение 30 мин. После охлаждения суспензии и отмывки водой добавляют

20 мкмоль проциона ярко-голубого

М-R и выдерживают смесь в течение

30 мин, затем добавляют N CO> до конечной концентрации 20 мг/мл и вы-. держивают 30 мин при 60 С. Полученный сорбент помещают в хроматографическую колонку и промывают формамидомД М KCE и водой до отсутствия оптической плотности на выходе с колонки

Пример 2. Выделение и очистка полинуклеотидфосфорилазы.

Получение голубого экстракта.

К суспензии 25 г биомассы Е.cori

МРЕ-600 в 75 мл 50 мИ трис-НСО (pH 8 О), 10 мМ МдС02, 0 5 мМ ЭДТА

0,2 мИ ДТЭ, 5Ъ глицерина (буфер ТМЭ) добавляют 20 мг лизоцима (марка Б, Олайне) и инкубируют на ледяной бане в течение 15 мин ° После добавления 0,1 мл Тритона Х-100 и дополнительной инкубации в течение 30 мин добавляют 25 мкл панкреатической

ДНКазы (10 мг/мл) и инкубируют еще

30 мин. После центрифугирования при

-О С в течение 60 мин при 5000 об/мин осадок отбрасывают, а суспернатант (грубый экстракт) используют для выделения фермента.

Фракционирование на ДЭАЭ-целлюлозе.

Грубый экстракт наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (Олайне) объемом л 170 мл, уравновешенную ТМЭ-буфероМ, рН 8,0 со скоростью 50 мл/ч.

После нанесения колонку промывают тем же буфером до отсутствия оптической плотности в элюате. Фермент с колонки элюируют 0,15 М КСР в

ТМЭ-буфере при рН 8,0. К полученному элюату (".750 мл) добавляют сухой (NH4) SO4 до степени насыщения 0,6.

Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин, Фракционирование на процион-силохроме.

Осадок белков растворяют в ТМЭбуфере (рН 9,0), содер. ащем 1 М КСР, полученный раствор наносят на колонку с аффинным сорбентом объемом 20 мл со скоростью 40 мл/ч. После нанесения колонку промывают. тем же буфером до отсутствия оптической плотности в элюате. ПНФазу элюируют бессолевым буфером, содержащим 50 мМ трис-НСР (рН 9,0) 0,5 мИ ЭДТА, 0,2 мМ ДТЭ, 5Ъ глицерина. Фракции, содержащие фермент, объединяют и концентрируют полинуклеотидфосфорилазу добавлением сухого (NH4)2 SO4 до степени насыщения .0,6.

На этой стадии достигается значительная очистка фермента из практически нефракционированного грубого экстракта — не менее чем в 14 раз.

1076445

Составитель О. Скородумова

Редактор В. Петраш Техред М.Тепер Корректор В. Бутяга

Тираж 522 Подписное..ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035,Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 651/23

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Фракционирование на биогеле А

1,5 М.

Осадок фермента растворяют в

0,5 мл ТМЭ-буфера (рН 8-,0) и наносят полученный раствор на колонку с биогелем A 1,5 M (15 мл) . Фракции, содержащие фермент, объединяют и до использования хранят при -20ОС без какой-либо дополнительной обработки.

На стадии достигается дополнительная очистка фермента (до б раз) и перевод в буфер необходимого состава.

Полученный по предлагаемому спо.собу фермент при электрофорезе 5 мкг в денатурирующих условиях гомогенен, 15 имеет удельную активность

470 ед. акт,/мг при степени очистки

240 °

Активность фермента на всех стадиях определяют по включению (С ) =

АМФ в кислотонврастваримый продукт.

Реакцию проводят при 37 С в присутствии 25 мМ АДФ, 10 мМ МдС8 1 мМ ЭДТА

0,15 М трис-НСД (рН 8,0). 3а единицу активности принимают количество

t фермента, катализирующее включение

1 мкмоль АМФ .в полимер в течение 1 ч в выбранных условиях.

Использование предлагаемого способа очистки полинуклеотидфосфорилазы по сравнению с известным позволяет упростить процесс очисткй ПНФазы путем сокращения количества стадий с одиннадцати до шести и использования более технологического метода разрушения биомассы по сравнению с растиранием с М 03 . При этом исклю. чаются нетехнологические стадии высокоскоростного ультрацентрифугирования, ультрафильтрации и диализа и малоэффективная стадия фракционирования сульфатом аммония, а также стадий хроматографического разделения белков с применением градиентного элюирования ° Кроме того, процесс упрощается за счет применения стадии аффинной хроматографии для очистки

ПНФаэы из практически нефракционированного (по белку) грубого экстракта клеток и многократного использования аффинного сорбента.