Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты
Патент 1081171
Авторы
Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты
Иллюстрации
Реферат
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, включающий лизис клеток в присутствии катионно ,го детергента, мочевины, этилендиаминтетраацетата натрия, хлористого натрия, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и снижения примеси рибонуклеиновой кислоты, в качестве катионного детергента используют этоний Гдихлоридэтилен- 1,2-биc-(димeтилiKapбoдeцoкcимeтил )aммoнияJ, а процесс выделения ДНК осуществляют при С.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК а91 ИИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3479391/28- i 3 (22) 31. 05. 82 (46) 23.03.84. Бюл. Р 11 (72) Е.П. Трохименко, Л. В. Кейсевич, Н.П,Пеньковская, M.Î.Ëoçèÿñêèé и А.Г.Середа (71) Киевский государственный институт усовершенствования врачей (53) 577.152(088.8)
{56) 1. Романенко Е.Б., Обухова Л.К.
Изменение метилирования ДНК у мышей с возрастом под влиянием гидрокортизона и антиоксиданта. Научн.докл. высш,школы. — "Биологические науки", 198 1, В 2, с. 63-70.
2. Никитинис В.И., Малеева Н.Е., Санько Ф.Д., Мирзабеков А.Д. Два простых метода выделения ДНК из различных источников с применением цетавлона. — "Биохимия", 1977, т. 42, вып. 10, с. 1783-1788 (прототип).
3(5g С 07 H 21/04; С 12 P 19/34 (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, включающий лизис клеток в присутствии катионно" .го детергента, мочевины, этилендиаминтетраацетата натрия, хлористого натрия, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и снижения примеси рибонуклеиновой кислоты, в качестве катионного детергента используют этоний (дихлоридэтилен- 1,2-бис-(диметил,карбодецоксиметил)аммония, а процесс выделения ДНК осуществляют при 3-8 С.
1081171
Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и предназначено для выделения ДНК из тканей животных.
Известен способ выделения ДНК из тканей, заключающийся в том, что пос-. ле разрушения клеток путем инкубации
i8 ч в среде, содержащей 0,14 М NaC1, 0,01 М цитрата Na, 0,1 М ЭДТА, 0,5Х дезоксихолата Na и проназу, препарат 10 трижды обрабатывают хлороформом,осаждают этанолом, инкубируют с PHK-азой, вновь трижды обрабатывают хлороформом, осаждают этанолом и переосаждают изопропанолом (1) .
Недостатками такого способа являются шестикратная обработка хлороформом для удаления белка, что делает способ весьма трудоемким, продолжительность процедуры выделения (4872 ч), применение ферментов — проназы с целью разрушения дезоксирибонуклеопротеидного комплекса (ДНП) и
РНК-азы для удаления PHK из целевого продукта. 25
Наиболее близким к изобретению является способ выделения ДНК из тканей животных, включающий замораживание и измельчение тканей с последующим разрушением клеток в, растворе, содержащем катионный детергент цетавлон (ЦТА-Br), SM мочевины, 0,1М ЭДТА, 2М NaC1.Ëèýàò трижды обрабатывают смесью хлороформа и изо— амилового спирта ° Из водной фазы с помощью ЦТА-Br осаждают ЦТА-соль ДНК, 35 промывают раствором, содержащим О, 1Х
ЦТА, 5М мочевину и О,SM NaC1, затем раствором 1М ацетата натрия в 70Х-ном спирте, 70Х-ным спиртом и получают
Na-соль ДНК, содержащую 10Х примеси
РНК Pj.
Известный способ имеет ряд недостатков, а именно: использование в ка. честве катионного детергента цетавлона, импортируемого из ФРГ и потому труднодоступного для лабораторий, необходимость проводить манипуляцию выделения ДНК при температуре свыше
20 С из-за плохой растворимости цетавлона при более низких температурах, что влечет за собой потери ДНК в процессе выделения, связанные с денатурацией ее молекулы, высокая растворимость катионного детергента цетав- > лона (ЦТА-Br) в органических растворителях, вследствие чего его концентрация понижается и для ее поддержания детергент приходится добавлять к исследуемому раствору.
Целью изобретения является -повышение выхода целевого продукта и снижение примеси рибонуклеиновой кислоты.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты,включающему лизис клеток в присутствии катионного детергента, мочевины,этилендиаминтетраацетата натрия, хлористого натрия, в качестве катионного
4 детергента используют этоний 1 дихлоридэтилен-1,2-бис-(диметилкарбодецоксиметил)аммония), а процесс выделения
ДНК осуществляют при 3-8 о
Способ осуществляют следующим образом.
Извлеченную из организма ткань замораживают в жидком азоте и растирают до порошкообразной консистенции, отмывают при 40С 0,01М фосфатным буфером, содержащим 0,14М NaC1, лизируют 20 мин при 37 С подогретым до 50 С раствором, содержащим 1Х этоQ ния, 0,1М Эдта, 5М мочевины и 2М NaC1.
К лизату добавляют равный объем хлороформа, интенсивно встряхивают 10 мин и центрифугируют 15 мин нри 4000 при 4-8 С, отсасывают водно-солевую о фазу. Осаждают ДНК из водно-солевого раствора, почижая концентрацию NaC1 до 0,5 М путем прибавления 5М раствора мочевины. Осадок отмывают и растворяют в соответствующем буферном растворе, а затем очищают от примесей РНК.
Пример 1. Навеску ткани сердца от 5-5 крыс (около 4 г) измельчают, замораживают в жидком азоте, растирают в фарфоровой ступке и отмывают в 40 мл 0,01М фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,14М
NaC1. Полученную суспензию центрифугируют 10 мин при 4000g, осадок ресуснендируют в 7 мл 0,01М фосфатного буфера рН 7,0 и добавляют к
38,5 мл подогретого до 50 С раствора, содержащего 1Х этония, 0,1М ЭДТА, 5М мочевину и 2М NaC1 Смесь энергично встряхивают и оставляют на 20 мин в термостате при 37 С. Затем к смеси добавляют равный объем хлороформа, энергично встряхивают 10 мин и центрифугируют 15 мин при 4 000g и температуре 4-8 С. Водную фазу отсасыУ и вают и вновь обрабатывают хлороформом до полного исчезновения слоя на з 10811 границе раздела органической и водной фаз. К водно-солевому раствору нуклеиновых кислот добавляют 2,33 объема 5 М раствора мочевины. Полученный осадок отделяют, отмывают в растворе, содержащем 0,5 М ИаС1, 5М мочевину и 0,1Х этония, а затем трижды в О, 1 M ацетате Na в 70 эта0 ноле и наконец в 70 и 960 этаноле.
Полученную этониевую соль ДНК раст- 10 воряют в 18 мл О, 14М NaC1.
После полного растворения осадка добавляют 2 мп раствора, содержащего
2,5 M ацетата Na и 0,001 М ЗДТА,тщательно перемешивают. ДНК в виде 15
Na-соли осаждают, добавляя к раствору 0,54 объема изопропанола. ОбразоBaBBIHHCH o a oK Na- o H HK H9BJIeKa ют стеклянной палочкой и вновь растворяют в О, 14М NaC1 К полученному 20 однородному вязкому раствору добавляют смоченный водой активированный уголь в количестве 15-207 от объема раствора и выдерживают в течение 1 ч при 40С, постоянно помешивая. Уголь 25 отделяют центрифугированием, а ДНК в виде Na-соли вновь осаждают изопропанолом. Полученную таким образом ДНК промывают в 96 этаноле, в смеси этао нол — этиловый эфир 1: 1, в эфире и высушивают сначала на воздухе, а затем при 1000С. Из 4 г ткани сердца крыс получают 4-6 мг очищенного препарата ДНК.
Пример 2. В качестве исходного материала используют селезенки крыс.
Способ выполняют аналогично примеру 1, но ткани для исследования берут в количестве 2 г, а фосфатного буфе- 40 ра и лизирующего раствора 10 и 55 мл соответственно.
В результате из 2 г ткани селе, зенки крыс получают 15-17 мл очищенного препарата ДНК.
Опытным путем установлено, что при выделении ДНК по известному спо-, собу выход ДНК составляет 70-75Х (20 исследований), по предлагаемому — до
857 (20 исследований).
Таким образом, выделение ДНК по предлагаемому способу позволяет получить положительный результат путем применения детергента этония, выпускаемого отечественной промьппленнос- 55 ческое вещество.
Преимущество предлагаемого способа заключается также в том, что процесс выделения выполняется при температуре 8-4 С, что препятствует де" натурации молекулы ДНК и снижает потери ее в процессе выделения. Кроме того, в отличие от известных способов, предлагаемый позволяет выделить
ДНК из тканей с низким ее содержанием, что необходимо для изучения механизмов регуляции биологических процессов на уровне матрицы ДНК не только в активно пролиферирующих тканях (лимфоидные органы, печень), но и в тканях с относительно малым содержанием ДНК (сердце, эндотелий сосудов) .
Сравнительная оценка результатов выделения ДНК различными способами представлена в таблице.
Ниже приведены данные о свойствах и характеристиках препаратов ДНК, полученных предлагаемым методом из селезенки и сердца крыс.
Молекулярный вес 17,77 10 млн. дальтонов
Гиперхромный эффект, 7. 30,0 4 0
Содержание фосфора, 7. 9,90+1, 1
П;: месь PHK. X 0,02 0,20
Примесь полисахаридов
Примесь деградированных продуктов ДНК,РНК Нет
Е Z O Ei>0 2,4
Температура плаво ления, С
Нет
72,0+1, 1
71 4 тью, позволяющего проводить выделение
ДЧК в оптимальном температурном режиме.
Существенное преимущество предложенного способа заключается в применении в качестве детергента этония дихлоридэтилен 1,2-бис-(диметилкарбодецоксиметила) аммония химической
1 формулы (СН, 1(СН ) СООС„,Н,Д .2СД
Ф плохо растворимого в органических растворителях и хорошо растворимого в воде при низких температурах, ранее использовавшегося как антисепти1081171
TKBHS
Еgbo/Еg8а
Примеси, _#_
Количество
jlHK9 X
PHK Белок
Известный способ
Вьщелить не удалось
Сердце
3-9
1,95
2,38
Селезенка
Предлагаемый способ
1,93
2,30
2,3
Сердце 85
Селезенка 85
1,5
1,93
2,30
2,3
Заказ 1472/21 Тираж 381 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5
Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4
Составитель В.Кузьмичев
Редактор H.джуган Техред М,Гергель Корректор 0.Тигор